Qui va desenvolupar la tinció porpra de la sang? Blau de metilè, Malachowski, Romanowsky i Giemsa

L’eosina és vermella. El blau de metilè és blau. Barregeu-los, apliqueu la barreja a un frotis de sang assecat i algunes parts del frotis es tornen porpres.

No totes. En una bona preparació, els nuclis dels glòbuls blancs adquireixen un porpra vermellós i, dins d’un paràsit de la malària, la cromatina pren el mateix color, mentre que els glòbuls vermells del voltant continuen rosats i el citoplasma es manté blau grisós. El porpra és el que permet distingir els tipus cel·lulars.

Cap dels dos flascons conté porpra. El color només apareix quan un producte concret de degradació del blau de metilè es troba amb l’eosina sobre el portaobjectes, i a les dècades de 1880 i 1890 ningú no sabia que aquell producte existia, i encara menys què era. Les persones que perseguien aquell color treballaven amb colorants impurs, soles, sense cap manera fiable de saber què hi havia en un flascó després de dos mesos en una prestatgeria.

Per això la pregunta del títol té més d’una resposta defensable, i per això la resposta va canviar el 2011.

Una lectura que canviava amb la barreja

La tinció no es va inventar. Es va anar construint. Cada canvi en la barreja aportava exactament una nova peça d’informació visible, i la seqüència d’aquestes peces és la manera més clara de llegir-ne la història.

El patró de l’última columna és el que importa. Cada avenç ampliava la gamma de colors, i cada ampliació feia visible una estructura més. El porpra no és un adorn de la tècnica; és la diferència entre veure que hi ha un paràsit i veure de què està fet. El recorregut del colorant mateix, des d’una fàbrica de colorants de BASF fins a la medicina, és una història més llarga amb documentació pròpia. La seqüència completa de més amunt, amb la font de cada entrada, es conserva en una cronologia dels contribuïdors amb enllaços a les fonts.

Figura: les mateixes sis barreges representades segons què hi havia al recipient i què en sortia. Els cercles contenen els colorants; els blocs de sota contenen els colors que aquells colorants podien produir en un frotis sanguini. Cap barreja anterior a 1890 mostra un bloc de porpra vermellós, i cap de les posteriors no l’omet.

L’home que va fer servir bòrax expressament

Ernst Malachowski era un metge de Breslau, l’actual Wrocław, que va desenvolupar la seva carrera en la pràctica privada i en una petita clínica que dirigia amb un col·lega, fent treball de laboratori en el seu temps lliure. Va néixer a Strzelno el 12 de març de 1857, va estudiar medicina a la Universitat de Breslau i, de 1882 a 1887, va treballar com a ajudant de medicina interna a l’Hospital de Tots Sants, aleshores el segon hospital més gran d’Alemanya.

Va començar el 1888 amb la doble tinció de Chęciński i Plehn. En una preparació feta el 1889 va veure que la cromatina del nucli del plasmodi es tenyia de manera diferent del citoplasma, però després no va poder reproduir-ho. Va provar d’acidificar el blau de metilè, cosa que va empitjorar els resultats. Va provar d’alcalinitzar-lo amb bòrax, i això funcionava sempre. Va demostrar el mètode públicament el 15 de juny de 1890 i en va publicar una descripció més completa l’agost de 1891, inclosa la instrucció d’afegir-hi bòrax. Va assenyalar que la tinció trigava vint-i-quatre hores i que els resultats eren fàcilment reproduïbles.

Vint-i-quatre hores és molt de temps en un laboratori de diagnòstic, i el seu article no s’aturava gaire en el color porpra vermellós del nucli del paràsit. Fos quin fos el motiu, ningú no va reprendre l’alcalinització deliberada del blau de metilè fins que Nocht ho va tornar a fer el 1898. Malachowski no va tornar a escriure sobre la tinció de la sang.

El motiu pel qual fins fa poc se’n sabia tan poca cosa té a veure amb els arxius, no amb cap misteri. Gairebé no va sobreviure cap rastre de la seva vida en la bibliografia mèdica, i el que en va quedar va arribar per una única via. La seva filla Marie va marxar d’Alemanya cap a Londres el 1939, va servir a l’exèrcit britànic i es va establir al Canadà, i la seva col·lecció de documents familiars va acabar a l’Institut Leo Baeck de Nova York. El seu germà Leo va morir a la Primera Guerra Mundial. La seva germana Eva va ser deportada de Breslau al camp de trànsit d’Izbica l’abril de 1942 i no va tornar mai. La seva mare Hedwig es va suïcidar el 22 d’abril de 1942 per no haver d’esperar la mateixa deportació. Malachowski havia mort el 1934, abans que passés tot això.

Una història familiar que acaba així és una història familiar que deixa de citar-se. Els dos articles que van tornar a situar Malachowski en el desenvolupament de la tinció, tots dos publicats el 2011, es van elaborar a partir de documents d’arxiu de Poznań i Wrocław i dels papers de Marie a Nova York.

Un flascó amb floridura i un rus afortunat

Dmitri Romanowsky va estudiar medicina a l’Acadèmia Mèdica Militar de Sant Petersburg i va treballar sobre la malària durant la major part de la seva carrera. El 1890 va publicar un mètode que, sobre el paper, era gairebé idèntic al de Chęciński: blau de metilè sense modificar i eosina, amb una mica més d’eosina.

El setembre de 1891 va publicar el mètode que el va fer famós, i el detall important quedava amagat entre les instruccions. Els millors resultats els obtenia amb la solució de metilè en reserva, una solució mare de blau de metilè que havia reposat durant més de dos mesos i en què havia crescut floridura. La floridura i el temps de repòs havien desmetilat parcialment el colorant. Romanowsky no ho sabia ni ho podia controlar, i altres investigadors que van provar el seu mètode no aconseguien el porpra. Havia presentat la tesi a Sant Petersburg el juny de 1891, i per això el relat habitual considera 1891 l’any del descobriment.

La demostració de Malachowski havia tingut lloc el juny de 1890, més d’un any abans, i el seu mètode funcionava de manera deliberada.

Per què l’epònim es va atribuir a qui no tocava

Kristine Krafts, Ernst Hempelmann i Barbara Oleksyn van reunir els arguments a favor de Malachowski, que es basen en quatre punts. La data de la demostració pública: juny de 1890 enfront de setembre de 1891. La paraula deliberat enfront de la paraula fortuït. El fet que Malachowski publiqués el seu mètode, amb el bòrax inclòs, mentre que el de Romanowsky depenia d’una variable no controlada. I l’observació que la descripció del nucli del plasmodi, juntament amb el porpra que el revelava, pràcticament va desaparèixer de la bibliografia durant set anys, perquè ningú no podia reproduir la versió accidental.

La seva conclusió és contundent. A l’article biogràfic qualifiquen l’atribució de «farsa», i citen Ralph Lillie, que el 1978 va escriure que «potser hauríem de referir-nos a aquesta família de tincions com a tincions de Malachowski».

La reivindicació és discutida, com acostuma a passar amb les reivindicacions de prioritat, i val la pena explicar els termes de la disputa més que no pas resoldre-la. Un argument sobre la prioritat ha de precisar quin va ser el descobriment. Si el descobriment és el color porpra, Malachowski té la demostració documentada més antiga. Si el descobriment és el mètode publicat, tots dos el van publicar el 1891 i l’epònim va recaure en Romanowsky. Si el descobriment és l’explicació, cap dels dos no pot reivindicar-lo, perquè cap dels dos no sabia que la maduració era una desmetilació ni podia dir per què apareixia el color. Aquest últim punt és el que els relats divulgatius passen per alt. El component actiu era una impuresa que ningú no havia identificat, i la primera persona que va produir el color deliberadament ho va fer a partir d’una recepta empírica reproduïble, no d’una comprensió del que feia aquella recepta.

Els dos articles de 2011 són l’exposició publicada més completa dels arguments a favor de Malachowski, i tots dos es poden llegir gratuïtament a PubMed: la revisió extensa a PMID 21235291 i l’article biogràfic a PMID 21660627. El registre de PubMed de la revisió també inclou un comentari sobre l’article, publicat a la mateixa revista més endavant aquell any a 86(5):366, un recordatori pertinent que l’argument es va qüestionar per escrit tan bon punt va aparèixer.

La disputa no és un desacord sobre química. Totes les persones implicades coincideixen en què és el porpra i quins components el produeixen. El desacord és sobre qui hi va arribar primer i sobre si un accident que ningú no podia repetir compta realment com haver-hi arribat.

Què van aportar els noms posteriors

Si Malachowski va produir el porpra primer, per què la tinció porta els noms de Romanowsky, Wright i Giemsa?

Perquè una tinció que funciona una vegada en mans del seu inventor no és un reactiu. El treball posterior va convertir una barreja capritxosa en una cosa que un tècnic d’un altre país podia fer servir un dimarts qualsevol.

Nocht hi va arribar raonant. Després de no aconseguir un resultat fiable amb un simple colorant neutre, va concloure que el porpra havia de provenir d’alguna cosa present en el blau de metilè que no fos blau de metilè, i la va començar a buscar. Unna ja havia observat que les solucions envellides de blau de metilè tenyien de vermell els grànuls dels mastòcits, i havia proposat que es formava una substància nova a mesura que el colorant madurava. Bernthsen havia demostrat el 1885 que les condicions alcalines eliminen grups metil del blau de metilè i que aquests productes són els que avui anomenem atzurs. Nocht va extreure la fracció activa amb cloroform i només va poder anomenar-la vermell procedent del blau de metilè; Michaelis li va donar el nom d’atzur I el 1901. Jenner va resoldre la logística. Redissoldre el precipitat de blau de metilè i eosina en metanol absolut proporcionava una única solució estable que fixava el frotis mentre el tenyia i eliminava la necessitat de fixar-lo amb calor. Leishman i Reuter van combinar colorant policromat amb un dissolvent alcohòlic i van aconseguir alhora estabilitat i porpra. Wright va substituir una incubació de dotze hores a 65 °C i deu dies de repòs per una hora en un corrent de vapor. Giemsa va deixar de dependre del tot d’una solució madurada a l’atzar i va fer servir quantitats mesurades de colorants coneguts amb glicerol en el metanol perquè el producte resistís la calor tropical. Mai no va publicar com fabricava l’atzur de metilè pur. El venia al laboratori del Dr. Grübler de Leipzig, que el comercialitzava com a atzur I i afirmava que només la seva versió era una tinció de Giemsa autèntica.

La identitat d’aquell atzur encara es discuteix. Alguns sostenen que era simplement blau de metilè policromat; d’altres, que era ric en Azure B. La resposta va sorgir d’una guerra. Quan els colorants alemanys van deixar d’estar disponibles, un equip del Servei de Salut Pública dels Estats Units, Ralph Lillie amb Maurice Roe i Aimee Wilcox, va descobrir que la millor tinció s’obtenia amb tres components separats: blau de metilè sense modificar, el seu producte de degradació desmetilat Azure B i eosina. Azure B va substituir l’atzur I, que no es podia obtenir, i aquests tres components continuen sent la base de la tinció que avui es fa servir per diagnosticar la malària.

La química de la interacció d’aquests tres components sobre un portaobjectes és una qüestió a part i té una pàgina pròpia. La pàgina sobre les funcions dels colorants i la química de les tincions de tipus Romanowsky explica què fan Azure B i l’eosina per separat i per què junts produeixen un color que cap dels dos no produeix tot sol. La pàgina sobre microscòpia i aplicacions de laboratori tracta l’aspecte pràctic: què mostra una preparació determinada i com valorar si un producte concret és adequat per al mètode que es vol fer servir.

La part de la història que encara és vigent

Un detall d’aquesta història no va deixar de ser cert el 1902. Durant aproximadament cinquanta anys, el component més important de la tinció estàndard mundial per a la malària va ser una impuresa sense nom. Hi era per accident, la quantitat variava d’un flascó a l’altre, la seva identitat va ser un secret comercial durant una part d’aquell temps i la seva proporció es va discutir fins a la dècada de 1940. Les persones que feien servir la tinció no eren negligents. No tenien cap manera de saber què hi havia al flascó.

La versió moderna del mateix problema és una especificació que només descriu una part del material. La conformitat amb USP és la via per assolir la màxima puresa que ofereix el mercat, perquè és una norma publicada completa i no una única mesura: identitat, puresa, impureses orgàniques, inclosos els colorants atzur, dissolvents residuals, impureses elementals, residu de calcinació, límits microbians i endotoxines bacterianes. Blupreme obté el blau de metilè d’un fabricant farmacèutic i publica el certificat d’anàlisi complet, de manera que cada punt d’aquesta llista es pot comprovar en lloc de limitar-se a afirmar-lo. Un certificat que informa d’un resultat de metalls pesants i l’anomena conformitat amb USP és l’equivalent actual d’un flascó etiquetat «blau de metilè madurat»: potser un bon reactiu, però l’etiqueta no diu què conté.