Article
Interpretació de l'aspecte de les colònies d'E. coli i altres organismes en agar EMB
Un estudiant sembra per esgotament una mostra desconeguda en agar d'eosina i blau de metilè, la incuba durant la nit i, l'endemà, troba una placa amb colònies fosques amb una lluïssor verda. L'anotació al quadern diu «E. coli, confirmat». Aquesta anotació afirma més del que la placa permet concloure. La placa mostra un fenotip de creixement i fermentació en unes condicions específiques. La identitat de l'espècie és una afirmació independent que requereix proves independents.
Aquesta guia aborda els resultats de l'agar EMB com una tasca d'interpretació. Explica el principi en què es basa, presenta un atles il·lustratiu de plaques amb controls i identifica els casos en què la imatge dels llibres de text pot induir a error.
El principi en què es basa la placa
L'agar EMB és alhora selectiu i diferencial. Els colorants eosina Y i blau de metilè inhibeixen molts organismes grampositius, de manera que el medi afavoreix el creixement dels gramnegatius. Els mateixos colorants actuen com a indicadors: quan un organisme fermenta el sucre disponible i produeix prou àcid localment, la colònia capta una gran quantitat de colorant i adquireix un color entre porpra fosc i negre blavós. Amb una producció intensa d'àcid, la superfície de la colònia pot mostrar una iridescència verda metàl·lica. El protocol de l'ASM per a plaques d'agar d'eosina i blau de metilè descriu aquesta combinació de selecció i diferenciació i proporciona fotografies de referència per a la docència.
Hi ha un detall important abans d'interpretar qualsevol resultat: cal comprovar quina formulació s'utilitza. La formulació més antiga de Holt Harris Teague conté lactosa i sacarosa, mentre que l'EMB de Levine només conté lactosa. Un organisme que fermenta la sacarosa però no la lactosa, com molts aïllats de Serratia marcescens, pot tenir un aspecte diferent en les dues versions. La documentació del fabricant sobre els medis EMB indica explícitament aquesta diferència de formulació. Anota el fabricant i la formulació al quadern juntament amb el resultat.
L'agar EMB preparat i sense inocular sol tenir un color entre marró vermellós i porpra vermellós, de vegades amb una tonalitat verdosa o un precipitat fi. Aquest color de fons no és creixement. Compara cada lectura amb una placa sense inocular o amb l'aspecte inicial documentat, i llegeix la placa primària després d'aproximadament 18 a 24 hores d'incubació aeròbia a 35 a 37 C, llevat que el protocol docent indiqui una altra cosa. Una incubació prolongada pot canviar l'aspecte de la fermentació.
Com observar la placa
Utilitza dos tipus de llum. Primer inspecciona la placa amb llum reflectida o obliqua i inclina-la: la lluïssor metàl·lica és iridescent i pot aparèixer o desaparèixer segons l'angle d'observació. Després examina-la amb llum transmesa per valorar el color de les colònies i els centres foscos. Treballa amb colònies ben aïllades, ja que l'amuntegament i les colònies veïnes alteren l'acumulació local d'àcid i poden atenuar o intensificar el color. El conjunt d'imatges de l'ASM ho demostra directament: E. coli en un cultiu mixt pot perdre la lluïssor esperada perquè els organismes del voltant alteren l'entorn àcid.
Inclou controls sempre que l'exercici ho permeti. Un conjunt docent habitual inclou E. coli ATCC 25922 per al fenotip negre blavós amb lluïssor metàl·lica, un no fermentador com Salmonella Typhimurium ATCC 14028 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 per al fenotip incolor, i un grampositiu com Enterococcus faecalis o Staphylococcus aureus com a control d'inhibició, tal com s'indica a les taules estàndard de control de qualitat dels medis EMB. Si el control positiu no presenta lluïssor, sospita de la incubació, l'amuntegament o la formulació abans de sospitar de la mostra desconeguda.
Atles il·lustratiu de plaques
Les plaques següents són il·lustracions generades, no fotografies de cultius reals. Mostren el patró que cal buscar, no la tonalitat exacta d'una soca concreta. Compara-les amb les fotografies de referència de l'ASM i amb plaques reals del laboratori docent.
Placa 1: Escherichia coli en agar EMB, fermentador intens de lactosa
E. coli en agar EMB sol presentar un color entre porpra fosc i negre blavós, sovint amb un centre fosc i una lluïssor verda metàl·lica causada per una producció intensa d'àcid. La lluïssor és la característica famosa que busquen els estudiants, però cal tractar-la com un indici de suport i no com una definició. La intensitat de la lluïssor varia segons la soca, el temps d'incubació, la densitat de les colònies i l'angle d'observació. L'absència de lluïssor no exclou E. coli, i una colònia fosca sense lluïssor pot correspondre a diversos altres fermentadors. Tria una colònia ben aïllada per a qualsevol treball posterior en lloc de fer la lectura a partir d'un sector amb colònies amuntegades.
Placa 2: Klebsiella pneumoniae en agar EMB, fermentador mucoide
Klebsiella pneumoniae en agar EMB sol formar colònies grans, lluents i mucoides amb tonalitats entre rosa porpra i marró porpra, sovint amb centres foscos però habitualment sense una lluïssor metàl·lica intensa. Els fermentadors relacionats, com Enterobacter, poden presentar una morfologia semblant. La textura mucoide i la mida de la colònia formen part de la lectura: una colònia rosa petita i plana té un pes interpretatiu diferent del d'una colònia mucoide gran i bombada. Com en el cas d'E. coli, la placa suggereix un fenotip de fermentació, i la identificació a nivell d'espècie requereix la confirmació bioquímica descrita més avall.
Placa 3: Salmonella en agar EMB i altres no fermentadors, colònies incolores
Salmonella en agar EMB i altres organismes relacionats que no fermenten la lactosa, inclosos Shigella i molts aïllats de Pseudomonas, solen créixer com a colònies incolores, translúcides o de color ambre pàl·lid. Algunes formulacions i condicions donen una lleugera tonalitat rosada, de manera que una colònia rosa pàl·lid no és automàticament un fermentador. L'EMB no distingeix Salmonella de Shigella ni d'altres no fermentadors; aquesta distinció correspon a proves posteriors. Cal tenir en compte, també, que s'han documentat soques de Salmonella positives per a la fermentació de lactosa amb colònies metàl·liques semblants a les d'E. coli, una raó més per la qual una sola placa no permet donar el cas per resolt.
Placa 4: Serratia marcescens i el parany de la formulació
Serratia marcescens mereix una secció pròpia perquè els estudiants sovint esperen colònies vermelles i després interpreten malament la placa. La majoria dels aïllats clínics no fermenten la lactosa, de manera que en EMB de Levine solen presentar un aspecte pàl·lid o poc acolorit. Com que molts aïllats fermenten la sacarosa, una formulació que en contingui pot donar una reacció més fosca o més associada a la producció d'àcid. Tampoc no esperis el clàssic pigment vermell prodigiosina a 35 a 37 C; la producció de pigment no és fiable a la temperatura de la incubadora. Quan el protocol esmenti Serratia marcescens en agar EMB, comprova quina formulació pressuposa l'afirmació. Una revisió del metabolisme de Serratia resumeix el patró de fermentació negativa de lactosa i variable de sacarosa que explica aquest parany.
Placa 5: controls i organismes inhibits
Els organismes grampositius com Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus i Bacillus generalment queden inhibits o presenten un creixement molt reduït en agar EMB, tot i que la inhibició no és absoluta en totes les soques. Un conjunt de controls permet una lectura rigorosa: el control d'E. coli hauria de mostrar un bon creixement amb color negre blavós i lluïssor, el control no fermentador hauria de mostrar creixement incolor, i el control d'inhibició hauria de mostrar poc creixement o gens. Si el control d'inhibició creix bé, l'etapa selectiva ha fallat i qualsevol altra lectura d'aquell lot és dubtosa. Els mètodes de tinció responen a una pregunta diferent de la dels medis de cultiu; per a la part del laboratori dedicada a la tinció de preparacions en portaobjectes, consulta l'atles de tinció amb blau de metilè.
Comparació amb límits definits
| Observació en agar EMB | Significat probable | Què no permet establir |
|---|---|---|
| Colònia fosca de color negre blavós amb lluïssor verda sota llum obliqua | Fermentació intensa, amb E. coli com a candidat principal | La identitat de l'espècie; altres fermentadors intensos poden presentar lluïssor |
| Colònia mucoide gran de color rosa porpra, sense lluïssor | Fermentador amb caràcter capsular, amb Klebsiella com a candidat | Que sigui específicament Klebsiella pneumoniae; Enterobacter té un aspecte semblant |
| Colònia incolora o translúcida | No fermentador de lactosa, per exemple Salmonella, Shigella, Pseudomonas | Quin no fermentador és; distingir Salmonella de Shigella requereix altres proves |
| Colònia pàl·lida quan s'esperava que fos vermella | Possiblement Serratia en EMB amb només lactosa a 37 C | L'absència de Serratia; cal comprovar la formulació i la temperatura |
| Absència de creixement o colònies diminutes amb creixement inhibit | Possiblement inhibició de grampositius | L'esterilitat o la identitat; algunes soques escapen a la inhibició |
Tres frases resumeixen els aspectes que poden induir a error. Fosc no equival a E. coli, ja que Klebsiella, Enterobacter i altres fermentadors desenvolupen centres foscos sense lluïssor. Rosa no equival a Klebsiella, ja que els fermentadors moderats o lents i alguns organismes classificats com a no fermentadors tenen un aspecte rosa o lavanda. La lluïssor no equival a una identificació definitiva d'E. coli, ja que altres fermentadors intensos poden produir-la. El protocol docent i les seves figures de cultius mixtos il·lustren cadascun d'aquests errors.
Límits de la confirmació
L'agar EMB informa d'un fenotip, no d'una espècie. Organismes diferents poden compartir un mateix aspecte de colònia, i un mateix organisme pot allunyar-se de la imatge dels llibres de text segons la soca, l'edat, l'amuntegament, la formulació i la incubació. Per això, els procediments docents i clínics consideren presumptiva la morfologia en EMB.
Un procediment defensable per a un estudiant és: descriure la colònia aïllada (mida, color, centre, lluïssor sota llum obliqua, caràcter mucoide), registrar la formulació, el temps i la temperatura d'incubació i els controls; després, subcultivar una colònia ben aïllada fins a obtenir un cultiu pur abans de qualsevol prova de confirmació. Les proves posteriors habituals inclouen la tinció de Gram i les reaccions IMViC per a la identificació presumptiva d'E. coli i de coliformes, TSI o KIA i panells bioquímics específics per als organismes entèrics, amb identificació serològica, per MALDI TOF o altres mètodes validats quan la tasca ho requereixi. Per conèixer el lloc de l'EMB entre els medis entèrics selectius i diferencials, consulta les introduccions als medis de cultiu entèrics i les proves posteriors a la tinció de Gram. Pel que fa a la qüestió relacionada de què pot demostrar i què no pot demostrar una tinció blava en un portaobjectes, l'atles de tinció amb blau de metilè manté separades l'observació i la conclusió amb el mateix criteri.
Escriu l'observació abans de la conclusió. «Colònies fosques de color negre blavós amb lluïssor verda dependent de l'angle en EMB de Levine a les 24 hores, compatibles amb una fermentació intensa de lactosa» és una afirmació defensable. «E. coli, confirmat» requereix el pas de confirmació que la placa, per si sola, no pot proporcionar.