El blau de metilè i la senyalització inflamatòria: inflamasomes, IL-6 i STAT3

Suposem que tres laboratoris informen que el mateix compost blau és antiinflamatori. Un mostra menys IL-1beta procedent dels macròfags. Un altre mostra menys enzim iNOS en el mateix tipus cel·lular. Un tercer mostra menys IL-6 a la sang i menys activitat de STAT3 al cervell. La temptació és fusionar els tres resultats en una sola afirmació. Aquesta fusió amaga la troballa.

Cada resultat correspon a un concepte de senyalització diferent, amb el seu propi estímul desencadenant, etapa d'assemblatge i indicador mesurat. El blau de metilè intervé en cadascun en un punt diferent. Si algun d'aquests efectes millora un resultat de salut és una qüestió a part, que tractem a la nostra visió general del blau de metilè i la inflamació. Aquesta pàgina se centra en les vies.

Via 1: assemblatge dels inflamasomes i caspasa-1

Un inflamasoma és una bastida proteica que es construeix segons la necessitat dins d'una cèl·lula mieloide. Els components són un sensor, un adaptador anomenat ASC i un enzim efector anomenat caspasa-1. Un cop s'ha assemblat, la caspasa-1 escindeix pro-IL-1beta i pro-IL-18 per generar-ne les formes secretades i pot desencadenar la piroptosi, una forma inflamatòria de mort cel·lular. El sensor en defineix el tipus: NLRP3 respon als cristalls i a les toxines formadores de porus, com la nigericina i l'ATP; NLRC4 respon a la flagel·lina bacteriana; AIM2 respon a l'ADN citosòlic de doble cadena, i la via no canònica respon al lipopolisacàrid intracel·lular.

L'activació necessita dos senyals. El primer senyal és la preparació: un lligand d'un receptor de tipus Toll impulsa la transcripció de NLRP3 i pro-IL-1beta dependent de NF-kB perquè els components estiguin disponibles. El segon senyal és l'assemblatge: un segon estímul fa que ASC s'oligomeritzi en agregats, que la caspasa-1 s'escindeixi per generar el seu fragment p20 i que s'alliberi IL-1beta p17 madura. Les espècies reactives d'oxigen mitocondrials i la captació de cristalls són factors coneguts que contribueixen al segon senyal de NLRP3.

L'estudi de 2017 en macròfags sobre la inhibició àmplia dels inflamasomes va provar el blau de metilè en tots dos senyals. En macròfags de medul·la òssia de ratolí preparats amb lipopolisacàrid, la nigericina, l'ATP i els cristalls d'urat monosòdic van induir, cadascun, l'alliberament d'IL-1beta i caspasa-1, així com la formació d'agregats d'ASC. El blau de metilè a una concentració de 20 a 200 micromolar va reduir tots tres indicadors de manera dependent de la dosi, sense matar les cèl·lules. La flagel·lina i Salmonella per a NLRC4, l'ADN de doble cadena i Listeria per a AIM2, i el lipopolisacàrid transfectat o E. coli viu per a la via no canònica van mostrar el mateix patró. El compost per si sol no va desencadenar l'alliberament, i les plaques de control no van mostrar cap efecte antibacterià; per tant, el resultat correspon a la resposta de l'hoste.

En etapes anteriors de la via, es van mesurar tres intervencions. El superòxid mitocondrial induït per la rotenona va disminuir amb el blau de metilè, i també va disminuir l'alliberament d'IL-1beta impulsat per la rotenona. La captació de microesferes fluorescents va disminuir, un resultat coherent amb una reducció de la fagocitosi abans de la detecció dels cristalls. Un reporter controlat pel promotor de NLRP3 amb dos llocs d'unió de NF-kB va mostrar menys activitat amb el blau de metilè, mentre que un promotor truncat sense aquests llocs no va respondre. En un tub sense cèl·lules, el blau de metilè també va reduir directament l'activitat de la caspasa-1 humana recombinant. Afegir el compost només durant la preparació o només durant l'activació continuava reduint l'alliberament d'IL-1beta, IL-18 i caspasa-1; per tant, totes dues etapes hi estan implicades.

Les proves en ratolins van concordar amb aquesta selectivitat. Una dosi letal de lipopolisacàrid va matar els animals de control en poques hores, mentre que el blau de metilè va millorar la supervivència; la IL-1beta peritoneal va disminuir, però la IL-6 en el mateix líquid no. En un model de peritonitis per Listeria, la IL-1beta peritoneal va disminuir, mentre que el recompte cel·lular total es va mantenir sense canvis. Els monòcits humans THP-1 es van comportar com els macròfags de ratolí en els quatre tipus d'inflamasoma. Un resultat sobre inflamasomes explica la maduració d'IL-1beta i IL-18, no pas totes les citocines. Per això, la forma de les cèl·lules immunitàries del cervell en els experiments amb micròglia i astròcits respon a una pregunta diferent de la de l'assemblatge de la bastida.

Via 2: transcripció d'iNOS mitjançant la unió de NF-kB i STAT1

La sintasa induïble d'òxid nítric, o iNOS, és pràcticament absent en repòs i es transcriu segons la necessitat. El lipopolisacàrid n'impulsa la transcripció principalment mitjançant la degradació d'IkB-alpha, seguida de la fosforilació de NF-kB i de la seva entrada al nucli. L'interferó-gamma ho fa principalment mitjançant la fosforilació de STAT1 per la cinasa Janus, seguida de l'entrada de STAT1 al nucli. A continuació, cada factor s'uneix al seu lloc del promotor d'iNOS. L'activitat enzimàtica i la inducció gènica són punts de control diferents, i un fàrmac pot actuar sobre un dels dos o sobre tots dos.

L'estudi de 2015 sobre la inducció d'iNOS en macròfags i ratolins endotoxèmics va situar l'efecte en el missatge. En cèl·lules RAW 264.7 i macròfags primaris de ratolí, el blau de metilè a una concentració d'1 micromolar, administrat 30 minuts abans del lipopolisacàrid, de l'interferó-gamma o de tots dos, va reduir la proteïna i el mRNA d'iNOS entre les 8 i les 24 hores, amb menys nitrit al medi i sense pèrdua de viabilitat. En ratolins als quals es van administrar 25 mg per kg de lipopolisacàrid, una única dosi de 5 mg per kg una hora abans va reduir la proteïna i el mRNA d'iNOS al pulmó, al fetge i al cor.

El detall distintiu és allò que no va canviar. La degradació d'IkB-alpha, la fosforilació de NF-kB, la fosforilació de STAT1 i l'acumulació nuclear de tots dos factors es van mantenir intactes. La interrupció es produïa una etapa més tard: els extractes nuclears van mostrar menys unió de NF-kB al seu element d'ADN després del lipopolisacàrid i menys unió de STAT1 després de l'interferó-gamma. La immunoprecipitació de la cromatina va confirmar una menor ocupació del promotor d'iNOS per tots dos factors dins de les cèl·lules. El factor de necrosi tumoral alfa, el promotor del qual també utilitza NF-kB, també va disminuir. Els factors s'activaven i arribaven al nucli, però s'unien amb menys eficàcia al seu ADN diana.

Cal observar el contrast amb la via 1. Aquest mecanisme afecta la unió del factor a l'ADN, utilitza STAT1 en lloc de STAT3 i mesura mRNA, proteïna i nitrit en lloc d'agregats d'ASC i fragments de caspasa-1. El nostre mapa de les dianes del blau de metilè en diferents models cel·lulars manté aquest nivell transcripcional separat de les mesures directes d'enzims i mitocondris.

Via 3: IL-6 sèrica i activació de STAT3 als teixits

La IL-6 transmet senyals a través de la família de receptors gp130 cap a la cascada de la cinasa Janus a STAT3. La STAT3 fosforilada forma dímers, entra al nucli i impulsa programes inflamatoris, mentre que la mateixa IL-6 és una diana de NF-kB. Així, totes dues formen un bucle de retroalimentació que sovint s'anomena eix IL-6–STAT3. Els indicadors habituals són la IL-6 sèrica en etapes anteriors de la via, la relació entre STAT3 fosforilada i STAT3 total, i enzims efectors com iNOS i COX2 en etapes posteriors.

L'estudi de 2023 en ratolins sobre IL-6 i STAT3 després del lipopolisacàrid va mesurar l'eix en diversos compartiments. Els ratolins mascles C57BL/6 van rebre 1 mg per kg de lipopolisacàrid diàriament durant tres dies, amb 5 o 10 mg per kg de blau de metilè 30 minuts després de cada dosi. El tercer dia, la IL-6 sèrica era més baixa en tots dos grups de blau de metilè que amb el lipopolisacàrid sol, mentre que la majoria de les altres citocines del panell no van canviar amb el tractament. Les relacions entre STAT3 fosforilada i STAT3 total eren més baixes al còrtex, a l'hipocamp i a la pell de l'orella, amb menys tinció microglial d'Iba-1, menys iNOS i COX2, i una pèrdua de pes parcialment atenuada.

Aquí cal tenir presents dues precaucions. Una IL-6 sèrica més baixa juntament amb una fosforilació de STAT3 més baixa als teixits és coherent amb la modulació de l'eix, però no permet identificar-ne el punt d'acció principal: una menor quantitat de citocina en etapes anteriors, una menor senyalització del receptor o una activitat alterada de les fosfatases podrien produir, cadascuna, la mateixa relació. A més, el pes durant tres dies d'exposició aguda és una mesura de l'animal sencer, no una puntuació de símptomes o de remissió. Aporta context més enllà d'una immunotransferència, sense convertir un resultat de senyalització en una afirmació terapèutica. La química diferenciada de la regulació redox mitocondrial transcorre en paral·lel a aquest mecanisme de citocines i no s'hi ha de fusionar.

Comparació de les vies: punts d'intervenció i indicadors mesurats

La taula evita tres extrapolacions no vàlides. Un resultat sobre agregats d'ASC no demostra un resultat sobre STAT3. Un resultat sobre la unió de STAT1 al promotor d'iNOS no demostra un resultat sobre STAT3, encara que totes dues proteïnes pertanyin a la família STAT. Un resultat sobre IL-6 sèrica no demostra una reducció de l'assemblatge dels inflamasomes: en l'experiment peritoneal, la IL-1beta va disminuir, mentre que la IL-6 no. Cada fila necessita el seu propi estímul desencadenant i el seu propi indicador mesurat. Per això, la lectura d'estudis cel·lulars, animals i clínics sobre el blau de metilè exigeix relacionar cada afirmació amb el nivell que s'hi ha mesurat.

Res d'això estableix la dosificació, la seguretat o el benefici en persones. Els models amb lipopolisacàrid són estímuls controlats per provar un mecanisme, no rèpliques d'una malaltia crònica, i administrar el compost juntament amb l'estímul posa a prova la prevenció d'un canvi induït, no la reversió d'una malaltia establerta. Cal mantenir aquesta explicació dels mecanismes separada dels resultats en pacients i valorar qualsevol afirmació sobre salut segons l'estudi en pacients que la sustenta.