Assajos de llevats amb blau de metilè: comptar cèl·lules vives o cronometrar la respiració

Hi ha dos tubs a la taula de laboratori. Tots dos són blaus. En un, les cèl·lules blaves observades al microscopi indiquen llevats morts. En l'altre, un tub que passa de blau a incolor indica que el llevat és viu i respira. El mateix colorant, lectures oposades. Si es confonen els dos assajos, totes les conclusions s'inverteixen.

Aquesta distinció és el fil conductor de tot l'article. El blau de metilè és un colorant redox: oxidat és blau; reduït és blau de leucometilè incolor. Un recompte de viabilitat aprofita aquesta química en una observació microscòpica breu. Un experiment de respiració l'aprofita en una reacció cronometrada del conjunt de la mostra. Cadascun necessita el seu propi protocol, els seus propis controls i la seva pròpia dosi d'escepticisme.

El recompte de viabilitat: una tinció breu, llegida sense demora

El protocol utilitzat en cerveseria és la versió més estandarditzada. Prepareu blau de metilè al 0.01% w/v en citrat de sodi al 2%, barregeu-lo 1:1 amb la suspensió de llevats i examineu la mescla després d'un interval breu i fix. Els intervals publicats van d'1 a 2 minuts al manual del Brewing Science Institute fins a uns 5 minuts en protocols de recerca, mentre que el mètode de microbiologia del vi de l'OIV exigeix examinar la mostra abans de 10 minuts. La concentració de colorant en la mescla de recompte queda prop del 0.005%. Carregueu una cambra de Neubauer millorada i, a uns 400x, classifiqueu les cèl·lules de color blau fosc com a no viables i les no tenyides com a viables. En el mètode de l'OIV, les cèl·lules de color blau clar es compten com a vives, cosa que ja apunta al problema de subjectivitat que es tracta més endavant.

La concentració cel·lular es calcula a partir de la geometria de la cambra. Quan es compta tot el quadrat central d'1 mm, les cèl·lules per mL són iguals a N multiplicat pel factor de dilució i per 10^4, on N és el recompte en aquesta àrea, tal com s'estableix als mètodes de l'ASBC per a llevats. La viabilitat és més senzilla: cèl·lules no tenyides dividides pel total de cèl·lules, multiplicat per 100. Compteu unes 400 cèl·lules per estimar la viabilitat, seguint l'estudi comparatiu de cerveseria publicat a FEMS i la pràctica de l'OIV. Apliqueu sempre el mateix criteri per als límits, per exemple incloure les cèl·lules sobre les línies inferior i esquerra de la quadrícula i excloure les que són sobre les línies superior i dreta.

Cal establir un criteri per als borrons abans de començar el recompte. Una convenció habitual compta un borró com una cèl·lula separada quan arriba aproximadament a la meitat de la mida de la cèl·lula mare, i conjuntament amb la mare si és més petit. Sigui quin sigui el criteri triat, apliqueu-lo a tots els quadrats i anoteu-lo al full de recompte perquè la persona següent el pugui repetir.

Full de recompte (imprimiu-lo)

Aquest full de recompte és un recurs original d'aquest article. Copieu-lo en una llibreta o imprimiu-ne un per mostra.

Viabilitat (%) = 100 x no tenyides / (no tenyides + blau fosc). Total de cèl·lules per mL = N x factor de dilució x 10^4, amb N obtingut de l'àrea definida de la cambra. Anoteu l'interval de tinció al costat del resultat, perquè un valor de viabilitat sense el temps corresponent no és reproduïble.

Per què varien els valors de viabilitat

El temps és la primera interferència, i actua en tots dos sentits. Les cèl·lules metabòlicament actives redueixen el colorant, de manera que una lectura massa primerenca pot detectar cèl·lules vives abans que l'hagin acabat de reduir i classificar-les erròniament com a mortes. Però l'exposició prolongada és tòxica per si mateixa i genera cèl·lules blaves realment danyades, produint una falsa tinció de mort cel·lular. Per això, un protocol docent de laboratori especifica que el recompte s'ha de fer abans de 5 minuts, tal com es documenta en un protocol docent sobre llevats de Wisconsin. La formulació prudent és que la classificació amb blau de metilè depèn del temps; per tant, cal fixar un interval breu i mantenir-lo constant en totes les mostres d'una sèrie.

Les mostres amb viabilitat baixa presenten un segon biaix. El mètode estandarditzat adverteix que el blau de metilè pot sobreestimar la viabilitat real per sota d'aproximadament el 80%, perquè les cèl·lules que encara redueixen el colorant no necessàriament conserven la capacitat reproductiva. La bibliografia cervesera descriu la mateixa manca de fiabilitat quan la viabilitat s'ha deteriorat considerablement. Considereu el blau de metilè una estimació ràpida i aproximada, i confirmeu les decisions crítiques sobre mostres de viabilitat baixa, com ara reutilitzar un cultiu per inocular-lo de nou, amb recomptes en placa o una tinció complementària.

Els efectes de la matriu són el tercer factor. El mètode de l'OIV treballa prop de pH 4.6 i adverteix que les mostres de pH baix amb una forta capacitat tamponadora impedeixen el comportament correcte del colorant. També desaconsella l'assaig per sobre de 100 g/L de sucre, on les cèl·lules presenten un blau clar enganyós. Una comparació experimental del pH de tinció va trobar canvis substancials en la sensibilitat al llarg de l'interval assajat, d'acord amb un estudi del mètode amb blau de metilè dependent del pH. Les restes són un parany a part: les partícules tenyides en mostres de macerat brutes imiten cèl·lules mortes i augmenten la variabilitat entre operadors.

Aquesta variabilitat està quantificada, no és anecdòtica. En un assaig de cerveseria de sis mesos descrit a la comparació de llevats publicada a FEMS, les mesures per duplicat amb blau de metilè van presentar una desviació estàndard mitjana del 6.1%, davant del 0.2% de la citometria de flux amb oxonol, amb diferències de fins a 13 punts percentuals entre dos operadors sobre la mateixa mostra. Una comparació quantitativa de mètodes de viabilitat de 2023 va trobar que la microscòpia de fluorescència i la citometria de flux eren considerablement més precises, alhora que mostrava que el rendiment depèn de l'espècie i de la matriu. La descripció clàssica del mètode de Painting i Kirsop (PMID 24430080) continua sent el punt de referència, i una revisió més àmplia dels assajos de viabilitat i vitalitat de llevats (PMID 25154541) situa el blau de metilè entre les proves complementàries, no pas entre les definitives. El blau de tripà no és automàticament una millora en aquest cas: informa de la pèrdua d'integritat de la membrana, mentre que el blau de metilè informa de la captació i de l'activitat reductora, de manera que les cèl·lules sotmeses a estrès poden classificar-se de manera diferent amb els dos colorants.

L'experiment de respiració: cronometreu la desaparició del blau

El segon assaig no utilitza mai el microscopi. Es posen llevats, glucosa i blau de metilè diluït en un tub tancat, i el cronòmetre mesura quant triga a desaparèixer el blau. A mesura que les cèl·lules metabolitzen, generen equivalents reductors que converteixen el colorant blau en la seva forma incolora, mentre que l'oxigen dissolt el reoxida. Quan les cèl·lules redueixen la disponibilitat d'oxigen, predomina la reducció neta i el tub es decolora. Per tant, el punt final reflecteix l'equilibri entre la respiració, la concentració de colorant i la disponibilitat d'oxigen, i s'ha d'expressar com a temps de reducció o de decoloració del blau de metilè, no com una taxa directa de consum d'oxigen molecular.

Utilitzeu un colorant molt més diluït que en els treballs de viabilitat perquè el temps quedi dins d'un interval pràctic. El manual de pràctiques obligatòries de l'AQA per al nivell A ho estandarditza bé: 1 g de glucosa per 100 mL d'aigua escalfada a uns 30 C, 5 g de llevat sec afegits immediatament abans de l'ús i una solució de treball de colorant prop del 0.001%, preparada diluint 0.1 mL d'una solució mare a l'1% fins a 100 mL. Barregeu 2 mL de suspensió de llevats i glucosa amb 2 mL de solució de treball de colorant, deixeu que s'equilibri a la temperatura de l'assaig, agiteu una sola vegada durant 10 segons, poseu en marxa el cronòmetre i no torneu a agitar. L'agitació reintrodueix oxigen i fa que el tub torni a ser blau, cosa que constitueix l'artefacte procedimental més important. L'AQA indica que la preparació normalment s'hauria de decolorar en uns 5 minuts a 35 C, amb mitjanes d'assaig de 275 s a 20 C, 128 s a 35 C i 145 s a 45 C. Són exemples d'un muntatge concret, no valors de referència universals. La relació quantitativa entre la velocitat de reducció i els llevats metabòlicament actius en condicions controlades està avalada per estudis específics de reducció, incloent-hi el treball indexat com a PMID 25773544 i l'estudi mecanístic publicat a Yeast (2014).

Demostració de l'evolució temporal (recurs original)

La taula següent és una demostració original elaborada per a aquest article amb el muntatge de tipus AQA descrit més amunt: 2 mL de mescla de llevats i glucosa més 2 mL de solució de treball de colorant prop del 0.001%, una sola agitació de 10 segons i, després, incubació sense pertorbacions. Les dades són lectures d'exemple en el format que hauria d'anotar un grup d'estudiants, amb l'índex de velocitat definit com 1 dividit pel temps de decoloració en segons. Feu l'assaig amb els mateixos tubs i substituïu aquestes dades pels valors mesurats.

Representeu l'índex de velocitat en funció de la temperatura per als tubs A, B i C. La corba puja i després s'aplana o baixa, que és el patró esperat d'un procés enzimàtic, no una línia recta. Els tubs D, E i F no són punts de dades d'aquesta corba. Són els controls que permeten interpretar-la.

Controls que donen sentit a cada assaig

Cada sèrie d'assajos de respiració necessita tres controls. El llevat bullit o mort, amb glucosa i colorant, hauria de mantenir-se blau, demostrant que la reducció ràpida depèn d'un metabolisme viu. El llevat viu amb colorant però sense glucosa afegida és un control de substrat, però cal esperar igualment una decoloració lenta, ja que el llevat consumeix les reserves endògenes. La glucosa amb colorant però sense llevat és el blanc químic, essencial perquè la glucosa en medi alcalí pot reduir el blau de metilè sense que hi hagi cap cèl·lula.

El recompte de viabilitat necessita un altre tipus de control: la constància del procediment. La mateixa solució mare de colorant, la mateixa proporció de mescla, el mateix interval de tinció, la mateixa àrea de la cambra i els mateixos criteris per als borrons i els límits, amb recompte a cegues sempre que sigui possible. Quan dos operadors discrepen en deu punts, el full de recompte acostuma a revelar-ne la causa: temps diferents, llindars de blau diferents o criteris diferents per als borrons. Les tècniques per preparar i observar cèl·lules tenyides estan relacionades amb els mètodes de tinció simple de bacteris, mentre que l'atles de tinció en microscòpia ofereix una visió més àmplia del que marca el colorant en diferents mostres. Pel que fa a la física de la lectura quantitativa de qualsevol intensitat de blau, la referència d'absorció amb les condicions especificades explica per què cada coeficient ha d'anar acompanyat de les seves condicions de dissolvent, pH i concentració.

Trieu l'assaig segons la pregunta. Quantes cèl·lules són vives ara mateix és una pregunta de recompte, que es respon al microscopi amb un full de recompte. Amb quina intensitat respira aquest cultiu és una pregunta cinètica, que es respon amb un cronòmetre i tubs controlats. El blau de metilè serveix per a totes dues, però mai al mateix tub i al mateix temps.