Paul Ehrlich i metilensko plavilo: kako je boja pomogla oblikovati otkrivanje lijekova

Doprinos Paula Ehrlicha medicini nije bio lijek. Bio je to argument o tome kako posmatrati lijek.

Godine 1878. predao je doktorsku disertaciju čiji je uvodni dio nosio naslov „Hemijsko shvatanje bojenja“. U njoj je tvrdio da bojenje tkivnog presjeka i bojenje komada tkanine slijede istu logiku. U oba slučaja boja se veže zbog hemijskog afiniteta između boje i materijala, a ne zato što tkivo upija, što je masno ili što mu oblik omogućava da zarobi pigment. Ehrlich je odrastao gledajući svog rođaka, patologa Karla Weigerta, kako priprema obojene presjeke, a njegovu pažnju nisu zadržavale slike nego činjenica da je boja birala gdje će dospjeti.

Ta tvrdnja zvuči skromno. Nije. Ako se boja veže za tkivo iz hemijskih razloga, onda je obrazac bojenja izvještaj o hemiji tog tkiva. Obojeni preparat na predmetnom stakalcu prestaje biti ilustracija i postaje mjerenje.

Odmah je nastavio razvijati tu ideju. Godine 1880. kombinovao je metilensko plavilo s kiselim fuksinom i smjesu nazvao neutralnom bojom, neutralen Farbkörper, koja je omogućavala razlikovanje različitih vrsta bijelih krvnih ćelija tamo gdje pojedinačne boje tada u upotrebi to nisu mogle. Dvije godine kasnije predstavio je metodu bojenja bacila tuberkuloze metilnim ljubičastim, a Koch je taj postupak usvojio u svom radu.

Teorija koja je kasnije ovim postupcima dala zajedničku osnovu zasebno je pitanje, a vrijeme njenog nastanka redovno se pojednostavljuje. Ehrlichova teorija bočnih lanaca, ideja da supstanca djeluje na ćeliju zato što su hemijski kompatibilne, pripada 1890-im godinama, a ne periodu njegovog rada s bojama. Raniji rad pružio je uvjerenje koje joj je prethodilo: selektivnost je hemijska, pa se zato može ciljano tražiti umjesto da se na nju slučajno naiđe.

Eksperiment koji je boju pretvorio u mapu

Godine 1885. Ehrlich je objavio monografiju o potrebama organizma za kisikom, s podnaslovom koji ju je opisivao kao analitičku studiju zasnovanu na bojama. Metoda se sastojala od ubrizgavanja boja čija boja zavisi od oksidacijskog stanja, a zatim poređenja načina na koji ih različiti organi reduciraju ili zadržavaju u postojećem stanju. Boja je korištena kao instrument, onako kako se koristi termometar: pokazivala je uslove unutar tkiva koji se nisu mogli neposredno ispitati. Ehrlich je cilj opisao kao određivanje redukcijske moći živih organa uz pomoć određenih boja.

Rezultat s metilenskim plavilom uslijedio je 1886, u radu o reakciji boje sa živim nervnim tkivom, koji je predstavljen medicinskom društvu prethodnog decembra. Metilensko plavilo uneseno je u krvotok žive životinje, a zatim su uklonjeni tanki presjeci tkiva i izloženi zraku kako bi se nakupljena bezbojna boja oksidirala, ponovo postala plava i pokazala gdje se sakupila. Nervne ćelije i nervna vlakna primali su boju, i to dovoljno selektivno da je tehnika postala standardna metoda prikazivanja nervnog tkiva. Spoj više nije bio samo sredstvo za bojenje koje se na laboratorijskom stolu nanosi na presjek mrtvog tkiva. Bio je marker koji se raspoređivao unutar živog tijela, a taj se raspored mogao očitati.

Svojstvo na kojem su počivala oba eksperimenta treba jasno navesti jer sve ostalo u ovoj priči zavisi od njega. Metilensko plavilo može reverzibilno mijenjati oblik. Njegov reducirani oblik, leukometilensko plavilo, bezbojan je, a u dodiru s kisikom ponovo prelazi u plavi kation. Otopina boje s glukozom u zatvorenoj tegli je bezbojna; kada se tegla otvori, postaje plava. Prema navodima, Ehrlich je to neposredno pokazao tretirajući obojene presjeke željeznim hloridom i zrakom te posmatrajući povratak boje. Boja koja mijenja boju s redoks stanjem svoje okoline služi kao sonda za tu okolinu.

Tako su se jedno uz drugo našla dva svojstva. Boja je mogla razlikovati jedno tkivo od drugog. A boja se mogla uključivati i isključivati promjenom oksidacijskog stanja.

Gledano unazad, drugo svojstvo predstavlja početak hemoterapije. Ako se spoj veže za jednu vrstu tkiva, a za drugu ne, onda bi isti spoj mogao dospjeti do jedne vrste organizma, a do druge ne. Ehrlich je taj zaključak iznio neposredno: ako se patogen može selektivno obojiti, bojenje bi moglo ukazivati na specifično štetno djelovanje na taj patogen. Boja bi se, prema tome, mogla koristiti kao lijek usmjeren na uzročnika, a ne na pacijenta.

Prvo ispitivanje na pacijentu nije bilo vezano za malariju. Godine 1890. Ehrlich je s psihijatrom Arthurom Leppmannom izvijestio da metilensko plavilo ublažava bol kod neuralgičnih i reumatskih stanja mišića, zglobova i tetiva. Njih dvojica raspravljala su o tome može li lijek djelovati na duševne bolesti i odlučila su da ga ne isprobaju. Italijanski ljekar Pietro Bodoni iz Genove ipak je to učinio. Naslov njegovog rada iz 1899. odnosi se na sedativno djelovanje kod različitih oblika psihoze: opisao je smirivanje četrnaest uznemirenih pacijenata i naveo da su drugi ljekari u Genovi već koristili boju u istu svrhu. Sedacija nije djelovanje na samu bolest, a ta se razlika u ovoj historiji stalno pojavljuje.

Rad na malariji uslijedio je 1891, s patologom Paulom Guttmannom, u bolnici Moabit u Berlinu. Metilensko plavilo dato je dvama pacijentima, a izvještaj je objavljen u časopisu Berliner klinische Wochenschrift od 28. septembra 1891. U prvom slučaju pacijent je uvečer 29. juna odjednom uzeo 0.5 g boje; očekivani napad nije se u potpunosti razvio, a jedina tegoba zabilježena nakon toga bila je blaga strangurija uz plav urin. Napadi groznice nestali su tokom prvih dana, a parazita više nije bilo u krvi najkasnije do osmog dana. Autori su zaključili da su njihova očekivanja u potpunosti ispunjena. Dva slučaja bez kontrolne grupe nisu dokaz. Potpuniji prikaz metilenskog plavila i malarije, uključujući savremena ispitivanja, pripada zasebnoj stranici, a ovdje je zanimljivo uže pitanje: koliko je Ehrlichovog obrazloženja opstalo kada se suočilo s parazitom.

Gdje je obrazloženje bilo održivo, a gdje je zakazalo

Od predloženog mehanizma nije mnogo opstalo, barem ne u obliku koji je Ehrlich predložio. Uredna verzija prema kojoj ravni triciklični kation klizi između parova baza u DNK parazita ne može se održati kada je riječ o rodu Plasmodium. Zaražena crvena krvna ćelija tako lako reducira metilensko plavilo da ono do parazita uopće ne dolazi kao planarni kation, a objašnjenje interkalacijom koje odgovara akridinskim bojama ne odgovara ovoj.

Ono što dokazi podržavaju složenije je. Metilensko plavilo inhibira glutation-reduktazu parazita pri koncentracijama koje se mogu postići kod pacijenta. Blokira pretvaranje hema u hemozoin, inertni pigment koji parazit stvara da bi izbjegao trovanje produktima vlastite razgradnje hemoglobina, približno jednako efikasno kao hlorokin i mnogo efikasnije od kinina. Njegovo redoks kruženje također stvara reaktivne kisikove vrste u ćeliji koja ih već proizvodi. Još nije razjašnjeno koji je od ovih mehanizama stvarni mehanizam djelovanja ili doprinose li svi.

Postoji dodatna komplikacija koja treba utjecati na način čitanja svake historijske tvrdnje o ovom spoju. Komercijalno metilensko plavilo iz tog perioda nije bilo jedna supstanca. Uzorci su sadržavali Azure B, monodemetilirani srodni spoj, a u starijim otopinama nakupljalo ga se više. Azure B je metahromatska boja s drugačijim ciljnim strukturama: dvolančanu DNK boji tamnoplavo, a RNK zeleno. Smjesa dviju boja koje dospijevaju na različita mjesta, u omjerima koje niko nije zabilježio, ne može podržati nedvosmislenu tvrdnju o tome šta je metilensko plavilo u njoj učinilo.

Sama boja nikada nije potisnula kinin. Metoda je postigla više. Ehrlichov učenik Wilhelm Roehl, koji je radio za koncern za proizvodnju boja i lijekova IG Farben, nastavio je razvijati derivate boja kao lijekove za tropske bolesti i osigurao alat koji je nedostajao: kanarinca zaraženog ptičijom malarijom kao rutinski model za probir potencijalnih spojeva. Werner Schulemann zatim je izmijenio bočni lanac, a nastala fenotiazinijeva sol izliječila je eksperimentalnu infekciju. I dalje je pacijente bojila plavo.

Trajni rezultat na kraju nije bila ni boja ni prstenasti sistem, nego bočni lanac. Dodavanje dialkilaminoalkilamino grupe promijenilo je ponašanje molekule, a taj je fragment opstao u svakoj kasnijoj preinaci. Kada se ta grupa zadrži, a fenotiazinijev prsten zamijeni akridinom, rezultat je kinakrin. Kada se umjesto njega uvede kinolin, rezultat je hlorokin. Pamakin, primakin i amodiakin, koji su svi još u katalogu antimalarika, nose istu grupu. Spoj koji nije uspio kao terapija dao je dio koji je uspio.

Veza s antipsihoticima vodi preko prstena, a ne preko lijeka. Razjašnjavanje strukture metilenskog plavila dovelo je Heinricha Augusta Bernthsena do osnovnog fenotiazinskog jezgra 1883, a upravo su na toj osnovnoj strukturi, s različitim supstitucijama, hemičari u kompaniji Rhône-Poulenc radili tokom 1940-ih u potrazi za antihistaminicima. Jedan od tih spojeva sintetiziran je krajem 1950. i ispitao ga je hirurg Henri Laborit, koji je primijetio da pacijente ostavlja mirnim i ravnodušnim. Njegova prva objavljena psihijatrijska primjena, kod pacijenta s manijom, uslijedila je u januaru 1952. Prvi antipsihotik više je daleki srodnik boje s kojom je Ehrlich počeo nego potomak njegovog antimalarika.

Tri navike koje vrijedi zadržati iz ove epizode

1. „Prvi sintetski lijek korišten u medicini“ opisuje kategoriju, a ograničenja te tvrdnje veća su nego što izraz sugerira. Izraz se ustalio; često citirani pregled Schirmera i saradnika u časopisu Neurobiology of Aging naziva metilensko plavilo prvim potpuno sintetskim lijekom korištenim u medicini. Hloral hidrat uveden je kao sintetski sedativ 1869, više od dvadeset godina ranije. Sam rad iz 1891. daje dio odgovora jer njegovi autori navode sintetske antipiretike koji su već bili neuspješni protiv malarije, među njima kinolin, antipirin i antifebrin. Ehrlichov vlastiti arsenski lijek za sifilis pojavio se još kasnije. Odbranjiva verzija tvrdnje odnosi se na metodu, a ne na prvenstvo: metilensko plavilo spada među najranije sintetske spojeve odabrane da djeluju protiv određenog organizma na osnovu hemijske teorije selektivnosti.
2. Selektivna raspodjela nije selektivna korist. Ehrlichov rezultat iz 1886. pokazao je da boja dospijeva u nervno tkivo. Gdje spoj dospijeva i šta radi kada tamo stigne dva su različita mjerenja, a prvo je mnogo lakše provesti. U tom su raskoraku otad opstajale brojne tvrdnje o metilenskom plavilu i mozgu.
3. Čistoća pripada dokazima, a ne marketingu. Historijski zapisi dvosmisleni su upravo iz tog razloga. Male strukturne razlike mijenjaju mjesto na koje ovaj spoj dospijeva, zbog čega certifikat analize mora biti vezan za konkretnu seriju, a ne ponuđen kao opća izjava da je proizvod ispitan. Prodavač koji tvrdi usklađenost s farmakopejskom monografijom, a ispituje samo teške metale, tvrdi više nego što izvještaj podržava. Blupreme nabavlja metilensko plavilo od farmaceutskog proizvođača i ispituje punu specifikaciju navedenu u monografiji: identitet, čistoću, organske nečistoće, rezidualne rastvarače, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine. Izvještaj se objavljuje uz proizvod, a stranica o metilenskom plavilu USP kvaliteta objašnjava te granice i zašto prvo treba potražiti rezultat za Azure B.

Hronološki pregled izvora

Hronološki slijed ključnih događaja, uključujući hemiju boja koja je prethodila Ehrlichu te razrede kvaliteta i specifikacije koji su uslijedili nakon njega, zasebno je izložen u historiji metilenskog plavila, a identitet samog spoja obrađen je na stranici šta je metilensko plavilo.

Ilustrativne table na kojima se ovaj prikaz zasniva, reproducirane u pregledu Krafts, Hempelmann i Skórska-Stania iz 2012, nisu jednako vrijedni dokazi, a jedan primjer pokazuje zašto. Tabla iz 1891. primarni je zapis ispitivanja; portret iz 1910. pored nje dokumentuje ugled u tom trenutku i ništa više. Stranice iz Andersagove bilježnice iz 1934. neposredni su trag zamjene kinolinskim prstenom, zapisan rukom samog hemičara.

Iskren sažetak Ehrlichovih eksperimenata s bojama glasi da je ispravno prepoznao selektivnost i metu, ali pogrešno objasnio mehanizam. Metilensko plavilo zaista se nakuplja u nervnom tkivu i zaista šteti parazitu malarije. Drugo ne čini zbog prvog, a hemijski razlog koji je ponudio za oboje bio je pogrešan. Ono što je nesporno dokazao trajnije je od tačnog mehanizma: spoj se može odabrati umjesto slučajno pronaći, i to na osnovu dokaza prikupljenih prije nego što ga iko da pacijentu.