Kako metilensko plavo ulazi u ćelije: redukcija, reoksidacija i raspodjela između membranskih faza

Posmatrajte kako endotelne ćelije u posudi unose metilensko plavo i najočiglednije tumačenje ujedno je i pogrešno. Medij gubi plavu boju, ćelije dobivaju plave granule, pa je bojilo sigurno prošlo kroz membranu u obliku plave molekule. Eksperimenti pokazuju drugačije. Plavi oblik gotovo da ne prolazi. Prolazi bezbojni oblik, a plava boja koju vidite u unutrašnjosti nastaje upravo tamo, nakon ulaska.

Taj obrat je važan jer određuje šta nam bojenje može, a šta ne može reći. Plave granule ukazuju na oksidirano bojilo koje je ponovo oksidirano i zadržano u organelama. One ne pokazuju ukupnu količinu bojila u ćeliji, ne pokazuju njegovu reduciranu frakciju i ne mjere biološki učinak. Da biste razumjeli zašto, pratite tri koraka: redukciju na površini, difuziju reduciranog oblika te reoksidaciju i zadržavanje u unutrašnjosti.

Dva oblika ponašaju se kao različite molekule

Oksidirano metilensko plavo je ravni, pozitivno nabijeni prstenasti sistem. Rastvara se u vodi, snažno apsorbira svjetlost u području od oko 600 do 700 nanometara i izgleda plavo. Ključan je naboj. Nabijena molekula s afinitetom prema vodi ne prolazi lako kroz lipidnu membranu, pa se u literaturi pažljivo opisuje kao relativno nepropusna kroz membranu, a ne potpuno nepropusna.

Reducirano metilensko plavo, koje se naziva leukometilensko plavo, bezbojno je, nenabijeno i rastvorljivo u mastima. Kada se ukloni naboj, membrana prestaje biti prepreka. Reducirana molekula lako difundira kroz nju, a kada uđe u odjeljak s izraženijim oksidirajućim uslovima, može ponovo izgubiti elektrone i vratiti se u plavi, nabijeni oblik koji ostaje zadržan u unutrašnjosti. Redoks hemija bojila stoga je ujedno i njegov mehanizam transporta. Promjena broja elektrona mijenja propusnost.

Elektroni za prvi korak dolaze iz same ćelije. Ćelije sisara prenose elektrone kroz plazmatsku membranu, premještajući redukcijske ekvivalente od unutarćelijskih donora prema akceptorima na površini. Ta aktivnost kroz plazmatsku membranu normalna je ćelijska funkcija prisutna u većini tipova ćelija, a reduktaza na površini endotelnih ćelija koja djeluje na tiazinska bojila ponaša se poput drugih reduktaza u jednom važnom pogledu: nastavlja raditi u prisustvu cijanida i azida pri dozama koje zaustavljaju kasnije korake. Ta razlika je ključ cijelog objašnjenja.

Raspodjela između faza proučavana je prva i gotovo je objasnila unos

Marian Irwin s Instituta Rockefeller postavila je 1929. jednostavnije pitanje. Možda je ulazak bojila samo raspodjela između vode i masnih slojeva ćelije, a sloj hloroforma može u laboratorijskom eksperimentu predstavljati te masne slojeve. U svojim spektrofotometrijskim studijama prodiranja mućkala je vodene rastvore bojila s hloroformom i upoređivala ono što prelazi u organsku fazu s onim što ulazi u žive ćelije algi.

Dva nalaza iz tog rada i dalje zaslužuju pažnju. Prvo, komercijalni rastvori metilenskog plavog sadržavali su trimetiltionin, koji se danas naziva Azure B, a ta je nečistoća prodirala brže od samog metilenskog plavog, naročito pri alkalnom pH, gdje prevladava oblik slobodne baze rastvorljiv u lipidima. Dio onoga što je izgledalo kao ulazak metilenskog plavog zapravo je bio selektivni ulazak Azure B. Drugo, pH je određivao ishod tako što je određivao stanje ionizacije, a oštećene ćelije propuštale su mnogo više bojila nego neoštećene. Koeficijenti raspodjele i stanje naboja određivali su šta apsorbiraju i umjetni sistem i živa ćelija, a sličnost između njih podržala je ideju o nevodenim slojevima na ćelijskoj granici.

Model je unaprijed prepoznao važnost lipida i ionizacije, ali nije mogao razlikovati bojilo koje se raspodjeljuje u svom izvornom obliku od bojila koje se hemijski mijenja na površini, prolazi u izmijenjenom obliku i vraća u prvobitni oblik u unutrašnjosti. Za tu razliku bio je potreban drugačiji eksperiment, koji je izveden sedamdeset godina kasnije na plućnom endotelu.

Redukcija izvana, zadržavanje iznutra

Merker i saradnici radili su s uzgojenim endotelnim ćelijama plućne arterije goveda i predložili slijed od tri koraka: oksidirano bojilo reducira se na ćelijskoj površini u svoj bezbojni lipofilni oblik, reducirani oblik difundira u unutrašnjost, a unutarćelijska reoksidacija obnavlja oksidirani oblik koji ne prolazi kroz membranu i zato se nakuplja. Njihova studija unosa tiazinskih bojila u endotelne ćelije zatim je ispitala taj slijed pokušavajući ga prekinuti na određenim mjestima.

Prvo sredstvo bio je fericijanid, akceptor elektrona koji ne može ući u ćeliju. Kada površinski enzimi reduciraju plavo bojilo u njegov bezbojni oblik izvan ćelije, fericijanid može preuzeti te elektrone i ponovo stvoriti plavo bojilo u mediju prije nego što ono uopće prođe kroz membranu. Dok god je fericijanid bio prisutan u suvišku (10 mikromolarnog bojila naspram 50 do 500 mikromolarnog fericijanida), unos bojila gotovo se zaustavljao, a tek nakon potrošnje fericijanida nastavljao se uobičajenom brzinom. Kinetika je isto pokazala na drugi način. Fericijanid je nestajao približno konstantnom brzinom, u skladu sa stalnim tokom površinske redukcije koji opskrbljuje posrednik sposoban za ponovno kruženje, dok je izvanćelijsko bojilo nestajalo eksponencijalno kako se njegova zaliha iscrpljivala. Konstantan tok uz iscrpljivanje zalihe znači da signal fericijanida odražava kontinuiranu redukciju, a ne napuštanje rastvora molekulama bojila.

Drugo sredstvo potpuno je uklonilo korak prolaska kroz membranu. Grupa je vezala toluidinsko plavo O, blisko srodno tiazinsko bojilo, za veliki poliakrilamidni lanac koji je bio prevelik da uđe u ćeliju u bilo kojem oksidacijskom stanju. Ćelije su i dalje reducirale vezano bojilo. Redukcija stoga ne zahtijeva pristup unutrašnjosti ćelije. Sistem koji je provodi izložen je na površini ili je s njom električno povezan.

Zatim je utvrđena razlika po kojoj je rad dobio naslov. Cijanid i azid pri koncentraciji od 2 milimolara snažno su suzbijali nakupljanje bojila, a pod mikroskopom su tamnoplave i ljubičaste inkluzije, koje inače okružuju jedro, gotovo nestale. Ipak, nijedan inhibitor nije usporio izvanćelijsku redukciju: kruženje fericijanida nastavilo se nesmanjenim intenzitetom, a polimer koji ne prolazi kroz membranu i dalje se reducirao. Blokada je bila u kasnijem koraku. Cijanid i azid zaustavljali su unutarćelijsku reoksidaciju i sekvestraciju, a ne površinsku redukciju. Kontrolna ispitivanja vijabilnosti podržala su to tumačenje jer su ćelije tokom tih tretmana zadržale svoj citosolni markerski enzim laktat-dehidrogenazu, pa gubitak unosa nije bio samo posljedica trovanja ili pucanja membrane.

Jedno upozorenje iz rada i dalje vrijedi. Plave inkluzije nalazile su se oko jedra, ali ne i u njemu, što je u skladu s oksidacijom unutar subćelijskih organela, ali studija nije utvrdila kojih. Slični obrasci u drugim tipovima ćelija nazivani su lizosomalnim na osnovu slabih dokaza. Zadržavanje smatrajte utvrđenim, a njegovu tačnu lokaciju privremenom pretpostavkom. Čitaoci koji prate kuda elektroni dalje odlaze mogu nastaviti s temom mitohondrijskog transporta elektrona i redoks procesa i širom slikom apsorpcije i raspodjele prema putu primjene.

Bojenje nije mjera izloženosti

Treća studija pokazuje šta se događa kada se ova logika unosa poveže s mjerenjem biološkog odgovora. Scott i saradnici utvrdili su da metil-beta-ciklodekstrin, šećerni torus prstenastog oblika, direktno veže metilensko plavo, uz konstantu asocijacije od oko 310 po molaru za inkluzijski kompleks naspram oko 5846 po molaru za dimerizaciju bojila. U fibroblastima L929 to vezivanje blokiralo je i bojenje ćelija i stimulaciju unosa glukoze: prethodna inkubacija s ciklodekstrinom spriječila je plavo bojenje, a njegovo naknadno dodavanje ubrzalo je odbojavanje. Kako je optički signal plave boje nestajao iz ćelija, aktivirani transport glukoze slabio je gotovo istovremeno.

Autori su tu korelaciju protumačili kao nalaz koji više podržava direktnu interakciju između bojila i proteina u putu aktivacije transportera glukoze nego dugotrajan mehanizam oksidativnog stresa. Taj je zaključak razuman, ali ima ograničenja. Eksperiment ne identificira protein, ne pokazuje vezivanje za sam transporter, a korelacija između odbojavanja i gubitka učinka ne može isključiti sve puteve posredovane redoks procesima.

Trajna pouka odnosi se na mjerenje. Optičko bojenje pokazuje vidljivo, oksidirano bojilo povezano s ćelijom. Potpuno propušta bezbojnu reduciranu frakciju, pa blijeda ćelija i dalje može sadržavati ekvivalente bojila, dok intenzivno obojena ćelija ukazuje na zadržano oksidirano bojilo, a ne na ukupnu izloženost tkiva ili veličinu učinka. Isto upozorenje vrijedi i na većoj skali: upoređivanje bojenja među tipovima ćelija ili tumačenje tamnog tkivnog presjeka kao dokaza veće izloženosti ponavlja početnu grešku iz posude. Unos je ciklus redukcije, difuzije i reoksidacije, a svaki pojedinačni prikaz plavog oblika pokazuje samo jedan njegov dio. Iz toga direktno proizlaze praktične posljedice za laboratorijsko bojenje i rukovanje te za tumačenje tvrdnji o dozi i izloženosti.