Metilensko plavo i leukometilensko plavo: jedan redoks-par, dvije boje

Studentica dodaje nekoliko kapi plave boje u tikvicu, kružnim pokretima miješa sadržaj i posmatra kako boja nestaje. Protrese tikvicu i plava boja se vraća. Između ta dva stanja ništa nije dodano niti uklonjeno osim elektrona i kontakta sa zrakom. Ta tikvica obuhvata cijelu temu ovog članka: metilensko plavo i njegov reducirani partner, leukometilensko plavo, međusobno se pretvaraju u reverzibilnom redoks-paru u kojem boja pokazuje stanje sistema.

Praktična poruka dolazi prva. Promjena boje ovdje nije sporedni efekat. Ona je analitički signal. Svako ko priprema formulacije s metilenskim plavim, koristi ga pri titraciji ili u nastavi treba znati napamet napisati polureakciju, navesti uslove koji je pomjeraju ulijevo ili udesno i imenovati nečistoće koje otežavaju tumačenje rezultata.

Par u jednoj jednačini

Oksidirano metilensko plavo je metiltioninijev kation: ravni fenotiazinijev sistem sa sumporom i dušikom u centralnom prstenu i dimetilamino grupom na svakom kraju, koji se isporučuje kao hloridna so. PubChem ga navodi kao metiltioninijev hlorid, C.I. Basic Blue 9. U vodi monomer apsorbira svjetlost oko 664 nm, što odgovara plavoj boji koju oko vidi.

Reducirano leukometilensko plavo (LMB) ima isti molekulski skelet, ali je dušik centralnog prstena protoniran, a hromofor narušen. Pri približno neutralnom pH nema naboja i gotovo je bezbojno, uz zanemarivu apsorbanciju u vidljivom području i snažnu ultraljubičastu traku oko 258 nm (PubChem zapis za leukometilensko plavo, CAS 613-11-6). Broj protona u polureakciji zavisi od pH jer se reducirani oblik protonira u kiseloj sredini (približne vrijednosti pKa oko 4.5 i 5.8). Tri režima obuhvataju praktični raspon:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, plavo <=> bezbojno (pri približno neutralnom pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), plavo <=> bezbojno (umjereno kiselo, 2 protona)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> dvostruko protonirana leuko-vrsta (jako kiselo, 3 protona)

Sva tri zapisa opisuju isti par u različitim stanjima protonacije, što literatura o redoks-ponašanju tiazinskih boja sistematski obrađuje. Zavisnost od pH slijedi Nernstovu jednačinu za Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, koja daje nagib od približno 29.6, 59.2 ili 88.7 mV po jedinici pH za m = 1, 2 ili 3. Izmjereni nagibi oko 28, 58 i 87 mV po jedinici pH potvrđuju ovu povezanost, pa navedeni potencijal bez pripadajućeg pH nema smisla.

Šta jednačina govori stručnjaku za formulacije

Iz stehiometrije proizlaze tri činjenice. Prvo, dva elektrona po molekuli znače da je metilensko plavo u ukupnoj reakciji dvoelektronski indikator i posrednik, a ne jednoelektronski prenosilac. Drugo, protoni učestvuju u reakciji, pa se formalni potencijal mijenja s pH kako je opisano iznad. Treće, formalni potencijal pri pH 7 iznosi oko +0.011 V u odnosu na standardnu vodikovu elektrodu (oko +0.53 V pri pH 0), što ovaj par svrstava među blage oksidanse: dovoljno snažne da preuzmu elektrone od dobrih donora kao što su NAD(P)H ili askorbat, a dovoljno slabe da ih predaju rastvorenom kisiku ili centrima sa željezom(III). Upravo taj srednji položaj omogućava boji da kruži između dva oblika umjesto da ostane u jednom od njih.

Koncentracija unosi dodatnu složenost. Iznad približno stotinu mikromola po litru u vodi, u skladu s prijavljenom konstantom disocijacije dimera na monomere od oko 170 do 250 uM pri pH 7, oksidirani kation se slaže u dimere i veće agregate s pomjerenom apsorpcijskom trakom oko 610 do 615 nm. Spektar čiji je vrh pomjeren zato može ukazivati na agregaciju, a ne na nečistoću. Prvo razrijedite, zatim procijenite.

Uslovi koji pokreću svaki smjer

Tabela ispod služi kao praktični laboratorijski pregled. Za redukciju je potreban donor elektrona; za ponovnu oksidaciju potreban je akceptor elektrona, a zrak je obično dovoljan.

Svaki red slijedi istu jednačinu. Mijenja se samo pokretačka sila. U tom smislu par je reverzibilan: put je isti, ali se pod suprotnim uslovima prelazi u suprotnim smjerovima.

Objašnjenje plave boce

Mehanizam ove demonstracije treba jasno opisati jer ona prikazuje ovaj par u malom. U alkalnom rastvoru glukoze baza potiče enolizaciju glukoze, a nastali enediolat reducira metilensko plavo u leukometilensko plavo, pa sadržaj tikvice postaje bezbojan. Protresanjem se rastvara kisik iz gasnog prostora iznad rastvora, kisik ponovo oksidira leuko-oblik i plava boja se vraća. Tokom mirovanja rastvoreni kisik se iscrpljuje u blizini površinske reakcijske zone i glukoza ponovo prevladava. Ciklus se ponavlja dok se glukoza ne potroši, a svako protresanje čini Nernstovu jednačinu vidljivom: povećajte aktivnost oksidansa i ravnoteža se pomjera prema plavom obliku.

Radikal između dva oblika

Ukupna reakcija prenosi dva elektrona, ali elementarni koraci prenose po jedan. Između plavog kationa i bezbojnog leuko-oblika nalazi se semihinonski radikalski međuprodukt koji se uglavnom disproporcionira nazad u ta dva oblika umjesto da se nakuplja. Njegov jednoelektronski potencijal od oko minus 0.23 V pri pH 7 znatno je niži od srednjeg potencijala ukupne dvoelektronske reakcije, zbog čega radikal ostaje slabo zastupljena vrsta u stacionarnom stanju. Važan je iz dva razloga. Pod osvjetljenjem boja prelazi u pobuđena stanja koja otvaraju radikalske reakcijske puteve, zbog čega su rastvori metilenskog plavog osjetljivi na svjetlost i zbog čega fotohemija treba biti dio svakog protokola ispitivanja stabilnosti. Uz to, pri visokoj koncentraciji oksidirani oblik dimerizira, što mijenja spektar i prividnu kinetiku bez promjene osnovnog para. Nijedna od tih činjenica ne narušava reverzibilnost. Obje objašnjavaju opažanja koja bi inače izgledala kao ireverzibilnost.

Demetilirani srodnici pomjeraju skalu

Uklanjanjem metilnih grupa s dva dimetilamino ogranka par se zadržava, ali mu se svojstva mijenjaju. Apsorpcijski maksimum se sa svakom demetilacijom monotono pomjera prema plavom dijelu spektra: metilensko plavo oko 664 nm, Azure B oko 654, Azure A oko 630, Azure C oko 615 i tionin oko 600 nm. Azure B, kojem nedostaje jedna metilna grupa, najbliži je srodnik: glavni metabolit metilenskog plavog i dokumentirana nečistoća u materijalu metilenskog plavog. Azure A i Azure C nastavljaju niz s istim redoks-aktivnim skeletom. Tionin, kod kojeg su obje amino grupe potpuno demetilirane, nalazi se na kraju niza s formalnim potencijalom od oko +0.06 V pri pH 7, u poređenju s +0.011 V za metilensko plavo, pa se primjetno lakše reducira. Redoks-potencijali u ovom nizu zavise od sredine i elektrode, zato vrijednosti upoređujte samo unutar istog skupa uslova. Zbog toga je profiliranje nečistoća pitanje redoks-ponašanja, a ne samo provjera čistoće. Nekoliko posto Azure B znači nekoliko posto drugog redoks-para u boci, a članak o Azure B kao nečistoći i metabolitu dokumentira kako se taj udio kontrolira.

Gdje se uključuje biologija

Unutar crvenog krvnog zrnca NADPH reducira metilensko plavo u leukometilensko plavo, a leuko-oblik prenosi elektrone na željezo(III) u hemu, vraćajući željezo hemoglobina u stanje željeza(II). Taj pojedinačni prijenos elektrona hemijska je osnova upotrebe metilenskog plavog kod stečene methemoglobinemije. Sve što slijedi nakon tog prijenosa, energetski metabolizam, tok elektrona u mitohondrijama i bilo koji biološki ishod, pripada temi mitohondrijskog transporta elektrona i namjerno se obrađuje tamo.

Kupujte par, a ne samo boju

Redoks-boja dobra je onoliko koliko je dobra njena specifikacija. Visoka čistoća je važna jer je metilensko plavo koje ne zadovoljava USP obično tekstilnog kvaliteta i sadrži Azure B, teške metale ili ostatke rastvarača koji mijenjaju redoks-očitanja i otežavaju određivanje završnih tačaka, a nijedan protokol bojenja ih ne provjerava. Većina prodavača koji tvrde da njihov proizvod zadovoljava USP ispituje samo teške metale i smatra posao završenim. Potpuna usklađenost obuhvata identitet, određivanje sadržaja, organske nečistoće, ostatke rastvarača, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine, a članak kako odabrati metilensko plavo farmaceutskog kvaliteta objašnjava kako čitati tu dokumentaciju. Blupreme sarađuje s farmaceutskim proizvođačem metilenskog plavog, provodi ispitivanja prema punoj USP specifikaciji i objavljuje potpuni certifikat analize (COA). Kada je boja mjerni signal, ta dokumentacija je dio instrumenta.