Bojenje metilenskim plavilom: mikroskopske metode i atlas stvarnih snimaka

Bojenje metilenskim plavilom olakšava razlikovanje inače slabo vidljivih ćelijskih obilježja u mikroskopiji svijetlog polja. Može pomoći učenicima da pronađu jedro ćelije sluznice obraza ili ispitaju obrise i raspored mikroorganizama. Međutim, plavi objekt predstavlja opažanje. Imenovanje organizma, njegovo mjerenje i utvrđivanje ukazuje li na bolest zasebni su zadaci.

Naslovna slika ilustruje princip kontrasta. Atlas u nastavku sadrži stvarne fotografije nezavisno dokumentovanih uzoraka, s izvornim podacima o njihovom porijeklu.

Šta otkriva metilensko plavilo?

Metilensko plavilo je bazna boja: njegov obojeni ion nosi pozitivan naboj. Kako OpenStax objašnjava u prikazu bojenja uzoraka, bazne boje stupaju u interakciju s negativno nabijenim ćelijskim materijalom i mogu učiniti ćelije uočljivijim na svjetlijoj pozadini. U odgovarajućim preparatima metilensko plavilo ističe područja bogata nukleinskim kiselinama i druge strukture koje vežu boju.

Kod jednostavnog bojenja jedna boja stvara kontrast. Zbog toga različiti organizmi mogu izgledati plavo, a da ne pripadaju istom organizmu. Korisna pitanja u početku su opisna: jesu li objekti okrugli ili izduženi, pojedinačni ili grupisani, ravnomjerno obojeni ili s vidljivim unutrašnjim razlikama? Pogledajte razliku između jednostavnog bojenja i bojenja po Gramu prije nego što boju protumačite kao rezultat klasifikacije.

Kontrast i rezolucija su različiti. Kontrast pomaže u razlikovanju objekta od njegove okoline; rezolucija omogućava razlikovanje detalja koji su blizu jedan drugom. Tamnija slika ne garantuje da će se razaznati više struktura. Niti svako tamno zrnce treba označiti kao organelu.

Nativni preparati, obojeni vlažni preparati i razmazi

Neobojeni, odnosno nativni, vlažni preparat omogućava posmatranje bez dodavanja boje, iako izdvajanje iz izvornog okruženja ipak mijenja uzorak. Kod obojenog vlažnog preparata reagens se dodaje dok materijal ostaje u tečnosti ispod pokrovnog stakalca. Kod fiksiranog razmaza materijal se raspoređuje na predmetnom stakalcu i prije daljnje obrade primjenjuje se određena metoda fiksacije. OpenStaxov pregled pripreme razlikuje vlažne preparate od fiksacije i objašnjava zašto fiksirani organizmi više ne omogućavaju posmatranje normalnog kretanja ili metabolizma.

Ovi preparati odgovaraju na različita pitanja:

Za poređenje u nastavi zabilježite neobojeni preparat prije nego što pregledate zaseban obojeni preparat izrađen prema nastavnom protokolu. Postavke osvjetljenja i snimanja trebaju biti uporedive. Ako fotografišete dvije različite ćelije, opišite ih kao primjere, a ne kao prikaz jedne ćelije prije i poslije bojenja.

Mikroskopski atlas: tri stvarna obojena uzorka

Ovaj atlas predstavlja originalan izbor i tumačenje tri mikrografije dostupne pod otvorenim licencama. Autori izvora navode uzorke i korištene boje. Nismo nezavisno potvrdili identitet njihovih uzoraka. Slike su prenesene bez izrezivanja, nakon konverzije u WebP bez gubitaka, bez dodavanja obilježja ili promjene boja.

Slika 1: ljudske ćelije sluznice obraza

Uzorak: ljudske ćelije sluznice obraza. Boja: metilensko plavilo. Uvećanje: 400×, prema navodu fotografa. Mjerna skala: nije dostupna; izvor ne navodi kalibrisanu veličinu piksela. Fotografija autora Fritzmann2002, 2017, iz izvora Ljudske ćelije sluznice obraza (bojenje metilenskim plavilom), pod licencom CC BY-SA 4.0. Ova reprodukcija zadržava tu licencu.

Počnite od izdvojene ćelije: njeno tamnije jedro lakše je razlikovati od okolne plave citoplazme. Zatim pregledajte preklopljene ćelije ispod nje. Preklapanje otežava praćenje granice i može stvoriti lokalno tamnije područje. Koristite ovu sliku za vježbanje praćenja obrisa, a ne za brojanje svake tamne mrlje kao jedra. Vodič za posmatranje ćelija sluznice obraza razrađuje vježbu prilagođenu ovom uzorku.

Slika 2: ćelije luka

Uzorak: ćelije luka, prema identifikaciji u izvoru. Boja: metilensko plavilo. Uvećanje: “200x” se pojavljuje u izvornom nazivu datoteke; nije nezavisno potvrđeno. Mjerna skala: nije dostupna; podaci o kalibraciji nisu navedeni. Fotografija autora Alvy16, 2019, iz izvora Ćelija luka 200x, pod licencom CC BY 4.0.

Izduženi odjeljci čine organizovan sloj. Uporedite njihove duge zajedničke granice s nepravilnim obrisima na slici 1. Obratite pažnju i na upadljiv tamni materijal te neravnomjernu svjetlinu vidnog polja. Fotografija ne utvrđuje identitet svake tamne naslage. Pokazuje zašto koristan zapis opažanja uključuje artefakte i neizvjesnost umjesto označavanja svega što poprimi boju.

Slika 3: kvasci koje izvor identificira kao Candida spp.

Uzorak: Candida spp., prema navodu fotografkinje. Boja: jednostavno pozitivno bojenje metilenskim plavilom. Uvećanje: nije dostupno. Mjerna skala: nije dostupna; kalibrisana veličina piksela nije navedena. Fotografija autorice Marte, korisnice Wikimedije Martunia.g, 2021, iz izvora Pozitivno bojenje metilenskim plavilom 2, pod licencom CC BY 4.0.

Uporedite guste plave skupine s manje zbijenim rubnim područjima. Pojedinačne obrise lakše je pratiti tamo gdje se objekti manje preklapaju. Naziv Candida potječe iz izvornog zapisa, a ne iz identifikacije vrste provedene na ovoj fotografiji. Ova slika također ne daje rezultat procjene vijabilnosti. Testovi vijabilnosti i respiracije kvasaca zahtijevaju vlastite uslove, kontrole i tumačenje.

Pravilno tumačenje mjerila

Ove slike omogućavaju vizuelno poređenje, a ne mjerenje u mikrometrima ili poređenje apsolutne veličine ćelija između slika. Navedeno uvećanje ne nadomješta nedostajuću kalibraciju kamere. Promjena veličine prikaza slike mijenja njeno prividno uvećanje.

Za vlastite slike uspostavite kalibraciju mjerenja pomoću poznatog standarda i odgovarajuće optičke konfiguracije. Nikonov vodič za mikrometriju objašnjava kako objektni mikrometar pretvara proizvoljne podjele na slici ili okularnoj skali u fizičke dužine. Zabilježite objektiv, konfiguraciju kamere i kalibraciju te na osnovu tih podataka dodajte mjernu skalu. Nemojte je određivati prema prosječnoj veličini ćelije navedenoj u udžbeniku.

Odgovara li sadržaj bočice metodi?

Bočica s oznakom metilenskog plavila nije potpuna laboratorijska specifikacija. Provjerite koncentraciju i jedinice, rastvarač, dodatne sastojke, predviđenu primjenu, dokumentaciju serije i upute. Sigurnosno-tehnički list reagensa opisuje opasnosti; upute za metodu određuju kako ga koristiti za predviđeni preparat.

Konkretan primjer je Merckova Löfflerova otopina metilenskog plavila. Proizvođač je označava kao reagens za mikroskopiju i opisuje njenu ulogu kontrastne boje u bojenju acidorezistentnih mikroorganizama. Navedena zapaljivost također pokazuje zašto “plava tečnost” nije dovoljan podatak za planiranje rukovanja ili zagrijavanja. Ta svojstva odnose se na tu formulaciju, a ne automatski na svaku vodenu otopinu metilenskog plavila.

Isto tako, eozin-metilensko plavilo agar je formulisan hranjivi medij. To nije boja za mikroskopske preparate koja se dobiva dodavanjem samog metilenskog plavila uzorku. Za drugačiji cilj snimanja uporedite alternative metilenskom plavilu za mikroskopiju.

Kod mikroskopskog kompleta za početnike krenite od njegove dokumentovane nastavne metode, poznatih gotovih preparata i navedenog reagensa. Ako bočica više nema etiketu ili se njen sastav ne može utvrditi, zamijenite je odgovarajućim dokumentovanim reagensom. Koristite zaštitu za oči i slijedite upute za rukovanje priložene uz konkretnu formulaciju. Ljudski materijal i nepoznati uzorci iz okoliša zahtijevaju primjenu postupaka nastavne laboratorije za rukovanje uzorcima i njihovo zbrinjavanje; bojenje nije zamjena za te postupke.

Zapišite opažanje prije zaključka

“Plavi ovalni objekti u skupinama” je opis koji se može opravdati na osnovu slike. “Određena infekcija” zahtijeva dokaze koje slika nije pružila. U bilježnici odvojeno zabilježite porijeklo uzorka, pripremu, reakciju bojenja i metodu identifikacije. Ta razlika čini jednostavnu sliku iz nastavne vježbe korisnom i sprečava da se privlačnoj mikrografiji pripiše tvrdnja koju ne može potkrijepiti.