মাইক্রোস্কোপির জন্য মিথিলিন ব্লুর বিকল্প: কাজ অনুযায়ী বেছে নিন

সাধারণ ব্যাকটেরিয়াল স্মিয়ারে কোষের আকৃতি দেখাই যদি লক্ষ্য হয়, তাহলে মিথিলিন ব্লুর পরিবর্তে ক্রিস্টাল ভায়োলেট ব্যবহার করা যেতে পারে। জীবিত কোষের ক্ষেত্রে আরও উপযুক্ত বিকল্প হতে পারে কোনো রঞ্জক ছাড়াই ফেজ কনট্রাস্ট। কোন পর্যবেক্ষণটি করতে হবে, তার ওপরই নির্বাচন নির্ভর করে।

ধরা যাক, দুই ব্যক্তি একই ব্যাকটেরিয়াল কালচার পরীক্ষা করছেন। একজন দণ্ডাকার কোষকে গোলাকার কোষ থেকে আলাদা করতে চান। অন্যজন জানতে চান কোনো ট্রিটমেন্ট ব্যাকটেরিয়াকে মেরে ফেলেছে কি না। যে রঞ্জক প্রথম ব্যক্তিকে স্পষ্ট ছবি দেয়, সেটি দ্বিতীয় ব্যক্তির প্রশ্নের কোনো ব্যবহারযোগ্য উত্তর নাও দিতে পারে।

বিকল্প বেছে নেওয়ার আগে এই বাক্যটি পূরণ করুন: “আমাকে ___-এর মধ্যে ___ পর্যবেক্ষণ করতে হবে, এবং কোষগুলোকে জীবিত রাখতে হবে / জীবিত রাখার প্রয়োজন নেই।” এই বাক্যই নির্ধারণ করে রঞ্জকটিকে কী কাজ করতে হবে।

নমুনা ও প্রশ্ন দিয়ে শুরু করুন

প্রথমে নির্ধারণ করুন কোষগুলোকে জীবিত রাখতে হবে কি না, তারপর কোন বৈশিষ্ট্যটি পর্যবেক্ষণ করতে হবে তা চিহ্নিত করুন:

• কোষগুলোকে জীবিত রাখতে হবে: চলাচল বা আকৃতির জন্য রঞ্জনবিহীন ফেজ কনট্রাস্ট বা DIC বিবেচনা করুন; নিউক্লিয়ার DNA-এর জন্য ফ্লুরোসেন্সসহ Hoechst 33342 বিবেচনা করুন; মেমব্রেনের অখণ্ডতার জন্য SYTO 9 ও প্রোপিডিয়াম আয়োডাইডের মতো যাচাইকৃত অ্যাসে বেছে নিন।
• কোষগুলোকে জীবিত রাখার প্রয়োজন নেই: ব্যাকটেরিয়ার মরফোলজির জন্য ক্রিস্টাল-ভায়োলেট সিম্পল স্টেইন বা নাইগ্রোসিন নেগেটিভ স্টেইন বিবেচনা করুন; Gram রিঅ্যাকশনের জন্য সম্পূর্ণ Gram-stain পদ্ধতি ব্যবহার করুন; ফিক্সড কোষের নিউক্লিয়ার DNA-এর জন্য DAPI ফ্লুরোসেন্স বিবেচনা করুন।

প্রতিটি শাখার সীমাবদ্ধতা তুলনা করতে এই সারণিটি ব্যবহার করুন। এগুলো পদ্ধতি বেছে নেওয়ার বিকল্প, বিদ্যমান কোনো প্রোটোকলে এক বোতলের বিকারক অন্য বোতল দিয়ে বদলানোর নির্দেশনা নয়।

সাধারণ স্মিয়ারের ক্ষেত্রে পদ্ধতিটি সতর্কভাবে প্রতিস্থাপন করুন

ব্যাকটেরিয়ার মরফোলজি এক রঙে দেখাই যদি কাজ হয়, তাহলে ক্রিস্টাল ভায়োলেট একটি ব্যবহারিক বিকল্প। FDA-এর Bacteriological Analytical Manual-এ সিম্পল স্টেইনিংয়ের উপযোগী দুটি ক্রিস্টাল-ভায়োলেট ফর্মুলেশন দেওয়া আছে। নথিভুক্ত ফর্মুলেশন এবং তার প্রস্তুতপ্রণালী ব্যবহার করুন; শুধু রঞ্জকের নাম দিয়ে কার্যকর বিকারকের গঠন নির্দিষ্ট হয় না।

Gram স্টেইনিংয়েও ক্রিস্টাল ভায়োলেট ব্যবহৃত হয়, কিন্তু তাই বলে ক্রিস্টাল-ভায়োলেট সিম্পল স্টেইন Gram স্টেইন হয়ে যায় না। ASM Gram-stain প্রোটোকলে ডিফারেনশিয়াল ফলাফল নির্ভর করে ক্রিস্টাল ভায়োলেট, আয়োডিন, ডিকালারাইজেশন এবং কাউন্টারস্টেইনিং ধারাবাহিকভাবে কাজ করার ওপর। ওই ধাপগুলো বাদ দিলে ছবি থেকে কী প্রতিষ্ঠা করা যায়, তা বদলে যায়। এই পার্থক্যের জন্য সিম্পল স্টেইনিং বনাম Gram স্টেইনিং দেখুন।

নাইগ্রোসিন সীমারেখা দৃশ্যমান করার একটি ভিন্ন উপায় দেয়: এটি পটভূমিকে গাঢ় করে, আর ব্যাকটেরিয়াল কোষগুলো তুলনামূলকভাবে হালকা থাকে। Merck-এর নাইগ্রোসিন নির্দেশনায় এমন একটি গুরুত্বপূর্ণ তথ্য রয়েছে, যা বিকল্পগুলোর সাধারণ তালিকায় বাদ পড়তে পারে। তাদের নির্দিষ্ট কার্যকর ফর্মুলেশনে ফর্মালডিহাইড রয়েছে। তাই কোষগুলো নিজে রঞ্জিত না দেখালেও শুধু “নেগেটিভ স্টেইন” শব্দদুটি থেকে জীবিত কোষের সঙ্গে সামঞ্জস্য আছে বলে ধরে নেওয়া যায় না। সম্পূর্ণ ফর্মুলেশন ও নমুনা প্রস্তুতি পরীক্ষা করুন।

জীবিত নমুনার ক্ষেত্রে অপটিক্স পরিবর্তনের কথা বিবেচনা করুন

আপনি যদি কোষের চলাচল বা বিভাজন দেখতে চান, আরেকটি রঞ্জক যোগ করলে পর্যবেক্ষণ জটিল হতে পারে। Nikon-এর স্বচ্ছ নমুনায় কনট্রাস্ট নির্দেশিকায় ব্যাখ্যা করা হয়েছে, ফেজ কনট্রাস্ট এবং ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট বা DIC নমুনার অপটিক্যাল বৈশিষ্ট্যের পার্থক্য ব্যবহার করে সেগুলো দৃশ্যমান করে। মাইক্রোস্কোপে প্রয়োজনীয় উপাদান থাকলে এগুলো জীবিত, রঞ্জনবিহীন কোষ দৃশ্যমান করতে পারে।

এই পছন্দে প্রস্তুতিটি রঞ্জনবিহীন থাকে, কিন্তু উপলভ্য তথ্যের ধরন বদলে যায়। কোনো সীমারেখা বা চলাচল অনুসরণ করা যায়, কিন্তু কোন অণু কনট্রাস্টটি তৈরি করেছে তা জানা যায় না। প্রশ্নটি যদি অণুর অবস্থান নির্ণয় নিয়ে হয়, তাহলে উপযুক্ত লেবেলিং পদ্ধতি বেছে নিন।

নিউক্লিয়ার DNA-এর ক্ষেত্রে Invitrogen-এর DAPI ও Hoechst স্টেইনের তুলনা ফিক্সড কোষে DAPI-এর প্রচলিত ব্যবহারকে আরও বেশি সেল-পারমিয়েন্ট Hoechst 33342 থেকে আলাদা করে; জীবিত কোষ লেবেলিংয়ের জন্য Hoechst 33342 বেশি ব্যবহৃত হয়। উভয়ের জন্যই ফ্লুরোসেন্স সরঞ্জাম প্রয়োজন। কোনোটিই রঙিন ব্রাইটফিল্ড স্টেইনের সরাসরি বিকল্প নয়।

রঞ্জকের সংস্পর্শ ও আলোকসজ্জাকে পরীক্ষামূলক শর্ত হিসেবে বিবেচনা করুন। কোষের আচরণই যদি আপনার পরিমাপ হয়, তাহলে রঞ্জিত ও রঞ্জনবিহীন প্রস্তুতির তুলনা করুন।

লাল কোষ মানেই স্বয়ংক্রিয়ভাবে মৃত কোষ নয়

ব্যাকটেরিয়াল মেমব্রেনের অখণ্ডতা মূল্যায়নে SYTO 9 এবং প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড প্রায়ই একসঙ্গে ব্যবহার করা হয়। BacLight ম্যানুয়াল অক্ষত মেমব্রেনকে সবুজ স্টেইনিং এবং ক্ষতিগ্রস্ত মেমব্রেনকে লাল স্টেইনিংয়ের সঙ্গে সম্পর্কিত করে। নমুনার জন্য এই ব্যাখ্যাটি যাচাই করা প্রয়োজন।

Rosenberg ও সহকর্মীদের 2019 সালের একটি গবেষণা সমস্যাটি দেখায়। ফসফেট-বাফারড স্যালাইনে কাচের ওপর 24-hour E. coli বায়োফিল্মে প্রায় 96% কোষ in situ প্রোপিডিয়াম-আয়োডাইড-পজিটিভ দেখা গিয়েছিল। কিন্তু সংগ্রহের পর গবেষকেরা অনুমান করেন, 82% কালচারযোগ্য ছিল। কনফোকাল ছবিতে লাল রঞ্জিত পদার্থের নিচে সবুজ অভ্যন্তরবিশিষ্ট কোষ দেখা যায়, যা বিভ্রান্তিকর সিগন্যালে এক্সট্রাসেলুলার নিউক্লিক অ্যাসিডের ভূমিকার ইঙ্গিত দেয়।

এই শতাংশগুলো গবেষণার প্রস্তুতিগুলোর ওপর করা ভিন্ন পরিমাপ বর্ণনা করে; এগুলো সর্বজনীন কোনো সংশোধন-গুণক নয়। মূল শিক্ষা হলো, সিগন্যালটি কী থেকে তৈরি হয়েছে তা পরীক্ষা করা। বায়োফিল্মে নিউক্লিক-অ্যাসিড রঞ্জক ক্ষতিগ্রস্ত কোষের ভেতরের উপাদানের পাশাপাশি কোষের বাইরের উপাদানও শনাক্ত করতে পারে। জীবিত থাকার বিষয়ে সিদ্ধান্তের জন্য গবেষকেরা কালচার বা বিপাকীয় সক্রিয়তার মতো পরিপূরক পরিমাপের পরামর্শ দেন, একই সঙ্গে স্বীকার করেন যে প্রতিটিরই সীমাবদ্ধতা রয়েছে।

বিকল্পটিতে আসলে কী রয়েছে তা পরীক্ষা করুন

বিকল্প কোনো স্টেইনিং পদ্ধতিতেও মিথিলিন ব্লু থাকতে পারে। Giemsa তার একটি উদাহরণ: Merck তাদের পণ্যকে azure-eosin-methylene-blue solution হিসেবে বর্ণনা করে, যা রক্ত ও বোন-ম্যারো স্মিয়ারসহ বিভিন্ন প্রয়োগের জন্য নির্ধারিত। ভিন্ন নমুনার জন্য এটি ভিন্ন একটি পদ্ধতি হতে পারে, কিন্তু মিথিলিন ব্লু বাদ দেওয়ার শর্ত এটি পূরণ করে না।

কোনো যৌগ বাদ দেওয়া যদি পরীক্ষার অংশ হয়, তাহলে ছবি তুলনা করার আগে বিকারকের পরিচয় ও ফর্মুলেশন পরীক্ষা করুন। মিথাইল ব্লু, মিথিলিন ব্লু এবং কাছাকাছি নামের রঞ্জকসমূহের নির্দেশিকায় নামের পার্থক্য ব্যাখ্যা করা হয়েছে।

ফলাফল ব্যবহারের আগে প্রতিস্থাপনটি যাচাই করুন

নতুন পদ্ধতির ক্ষেত্রে প্রতিনিধিত্বশীল নমুনা এবং উপযুক্ত কন্ট্রোল ব্যবহার করে ছোট আকারে তুলনা করুন। সম্ভব হলে মাইক্রোস্কোপের সেটিংস তুলনাযোগ্য রাখুন। বিকারকের ফর্মুলেশন, নমুনা প্রস্তুতি, এক্সপোজার এবং ইমেজিংয়ের শর্ত নথিভুক্ত করুন, যাতে দেখতে ভালো কোনো ছবি কেবল পছন্দ না করে তার কারণও পরীক্ষা করা যায়।

মূল প্রশ্নের ভিত্তিতে সাফল্য বিচার করুন। মরফোলজির ক্ষেত্রে কোষের সীমারেখা ও বিন্যাস ব্যাখ্যাযোগ্য থাকে কি না মূল্যায়ন করুন। নিউক্লিয়ার লেবেলিংয়ের ক্ষেত্রে সিগন্যালের অবস্থান ও ব্যাকগ্রাউন্ড মূল্যায়ন করুন। জীবিত থাকার ক্ষেত্রে শুধু আকর্ষণীয় রঙের বিভাজনের চেয়ে বেশি প্রমাণ দাবি করুন। মিথিলিন ব্লু স্টেইনিং ও ল্যাবরেটরি প্রয়োগের বিস্তৃত নির্দেশিকায় পর্যবেক্ষণ ও প্রস্তুতির পারস্পরিক সম্পর্ক ব্যাখ্যা করা হয়েছে।

আপনার প্রয়োজনীয় পরিমাপটি যে বিকল্পে অক্ষুণ্ণ থাকে, সেটিই বেছে নিন। ফলস্বরূপ ছবির বৈশিষ্ট্যগুলোর মধ্যে রঙ কেবল একটি।