কেন মিথিলিন ব্লুর শোষণ ঘনত্বের সঙ্গে পরিবর্তিত হয়

একটি স্টক বোতল মিথিলিন ব্লু নিন এবং দুটি গ্লাসে ঢালুন। প্রথমটিতে স্টক দ্রবণ থেকে পূর্ণ করুন এবং দ্বিতীয়টিতে দশগুণ পাতলা করা দ্রবণ নিন। দ্বিতীয় গ্লাসটি প্রত্যাশামতো ফ্যাকাশে হবে। ভালো করে লক্ষ্য করলে আরও একটি পরিবর্তন দেখা যাবে। বর্ণের পরিবর্তন হয়েছে। একটি দ্রবণ পরিষ্কার আকাশি নীলের দিকে ঝোঁকে এবং অন্যটি বেগুনি আভাযুক্ত নীলের দিকে। পাতলা করা শুধু তীব্রতা কমায়নি। এটি কোন রাসায়নিক প্রজাতি সবচেয়ে বেশি শোষণ করছে তা পরিবর্তন করেছে।

এই পরিবর্তনের ধারণাটি সহজ। দ্রবীভূত মিথিলিন ব্লু একটি মাত্র প্রজাতি নয়। একক রঞ্জক ক্যাটায়ন, যাকে মনোমার বলা হয়, মুখোমুখি স্তূপ হয়ে দ্বিতীয় ক্যাটায়নের সঙ্গে যুক্ত হয়ে ডাইমার তৈরি করতে পারে, এবং ডাইমার আরও বড় অ্যাগ্রিগেটে পরিণত হতে পারে। প্রতিটি রূপের নিজস্ব শোষণ বর্ণালী রয়েছে। একটি স্পেকট্রোফটোমিটার যে মান দেখায় তা হলো সেই কিউভেটে, সেই অবস্থায় উপস্থিত মিশ্রণের যোগফল। মিশ্রণ পরিবর্তন করুন এবং বর্ণালী সরে যাবে, এমনকি মোট রঞ্জকের পরিমাণ সরল পাতলা করার অনুপাত অনুসরণ করলেও।

মনোমার ও ডাইমার ভিন্ন শোষক

মনোমারকে একটি সমতল কার্ড হিসেবে কল্পনা করুন যার রিং সিস্টেম জুড়ে ধনাত্মক চার্জ ছড়িয়ে আছে। দুটি এমন কার্ড মুখোমুখি অবস্থায় থাকতে পারে। ধনাত্মক চার্জ একে অপরকে বিকর্ষণ করে, কিন্তু সমতল অ্যারোমেটিক পৃষ্ঠগুলো স্ট্যাকিং ইন্টারঅ্যাকশনের মাধ্যমে আকর্ষণ করে, এবং আশেপাশের পানি ও কাউন্টারআয়ন এই বিকর্ষণকে কমিয়ে দেয়। ফলাফল হলো একটি যুক্ত জোড়া যার ইলেকট্রনিক অবস্থা ভাগ করা থাকে। এর অনুমোদিত ট্রানজিশন মনোমার ট্রানজিশনের তুলনায় বেশি শক্তির অবস্থানে থাকে, তাই ডাইমার ব্যান্ড মনোমার ব্যান্ডের তুলনায় কম তরঙ্গদৈর্ঘ্যে দেখা যায়, এবং বড় অ্যাগ্রিগেটগুলো নীল দিকের দিকে আরও অবদান রাখে, যা একটি শোল্ডার তৈরি করে।

খুব কম ঘনত্বের পরিষ্কার পানিতে মনোমার প্রধান থাকে এবং দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ব্যান্ড প্রাধান্য পায়। মোট ঘনত্ব বাড়লে যুক্ত রূপের অংশ বাড়তে থাকে এবং প্রথম ব্যান্ডের তুলনায় ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ব্যান্ড বৃদ্ধি পায়। তাই দুটি ব্যান্ডের অনুপাত মোট ঘনত্ব সরাসরি নয়, বরং মিশ্রণের গঠন নির্দেশ করে। কোন রূপ উপস্থিত আছে সে সম্পর্কে অনুমান ছাড়া একটি একক তরঙ্গদৈর্ঘ্য পাঠ দুটি রূপকে আলাদা করতে পারে না।

এই কারণেই রেফারেন্স বর্ণালী সবসময় নির্দিষ্ট অবস্থার সঙ্গে যুক্ত থাকে। মিথিলিন ব্লুর বর্ণালী রেফারেন্স দ্রাবক, লবণের পটভূমি, pH, তাপমাত্রা এবং ঘনত্ব পরিসরের সঙ্গে ব্যান্ড অবস্থান তালিকাভুক্ত করে। এই অবস্থাগুলো ছাড়া একটি পিক উল্লেখ করলে সংখ্যাটি অসম্পূর্ণ থাকে। একই রঞ্জকের ভিন্ন বর্ণালী সম্পর্কে দুটি পরীক্ষাগারই সঠিক হতে পারে, কারণ তারা ভিন্ন মিশ্রণ পরিমাপ করেছে।

কী সাম্যাবস্থা পরিবর্তন করে

ঘনত্ব হলো প্রধান নিয়ামক। ডাইমার তৈরি হতে দুটি মনোমারকে মিলিত হতে হয়, তাই মোট রঞ্জকের সঙ্গে এর অংশ সরলরৈখিকের চেয়ে দ্রুত বাড়ে। ঘরের তাপমাত্রার কাছাকাছি জলীয় দ্রবণে রিপোর্ট করা ডাইমারাইজেশন ধ্রুবক হাজারের ঘরে থাকে, তাই মাইক্রোমোলার পরিসরে ডাইমারের অংশ দ্রুত বৃদ্ধি পায়। মাইক্রোমোলার থেকে মিলিমোলার পর্যন্ত বিস্তৃত একটি বৈশ্বিক ফিটে দেখা গেছে যে 34 মাইক্রোমোলারের নিচেও টেট্রামারের অবদান শূন্য নয়, যা সতর্ক করে যে কয়েক দশক মাইক্রোমোলার ঘনত্বে কঠোর দুই-প্রজাতির ফিটের উপর নির্ভর করা উচিত নয়। সঠিক ভগ্নাংশ মাধ্যমের উপর নির্ভর করে, তাই এই নিবন্ধে সার্বজনীন রূপান্তর টেবিলের বদলে দিকনির্দেশ দেওয়া হয়েছে।

লবণ হলো দ্বিতীয় নিয়ামক। দ্রবীভূত আয়ন দুটি ক্যাটায়নের মধ্যকার বিকর্ষণ কমায়, তাই একই রঞ্জক ঘনত্বে যোগ করা সোডিয়াম ক্লোরাইড এবং অনুরূপ ইলেক্ট্রোলাইট মিশ্রণকে ডাইমার ও অ্যাগ্রিগেটের দিকে ঠেলে দেয়। এই প্রভাব লবণাক্ত ও জলীয় মাধ্যমে মিথিলিন ব্লু অ্যাগ্রিগেশন সম্পর্কিত গবেষণায় দেখা যায়, যেখানে প্রায় 1 মাইক্রোমোলার থেকে 3.4 মিলিমোলার রঞ্জক 0 থেকে 0.15 মোলার সোডিয়াম ক্লোরাইডে পরিমাপ করা হয়েছিল। সেই ফিটে উচ্চ রঞ্জক ও উচ্চ লবণ অবস্থায় টেট্রামারের অংশ প্রায় 0.93 পর্যন্ত পৌঁছেছিল। তাই পানিতে রেকর্ড করা বর্ণালী এবং শারীরবৃত্তীয় লবণাক্ত দ্রবণে রেকর্ড করা বর্ণালী বিনিময়যোগ্য মান নয়।

তাপমাত্রা বিপরীত দিকে কাজ করে। স্ট্যাকিং যুক্ত পানিকে মুক্ত করে এবং তাপীয় গতির দ্বারা বাধাপ্রাপ্ত হয়, তাই দ্রবণ গরম করলে সাধারণত কিছু ডাইমার আবার মনোমারে বিচ্ছিন্ন হয়, আর ঠান্ডা করলে সংযোজন বৃদ্ধি পায়। 282 থেকে 333 কেলভিনে ফিট করা বিচ্ছেদ এনথ্যালপি ঋণাত্মক, প্রায় মাইনাস 30 কিলোজুল প্রতি মোল, যা বহির্গামী তাপীয় সংযোজন নিশ্চিত করে। ফ্রিজ থেকে বের করা ঠান্ডা নমুনা ঘরের তাপমাত্রায় সাম্যাবস্থায় আনার পর মাপা একই নমুনার তুলনায় বেশি অ্যাগ্রিগেটেড দেখাতে পারে।

দ্রাবক ভিত্তি নির্ধারণ করে। পানি, যার শক্তিশালী হাইড্রোফোবিক প্রভাব রয়েছে, সমতল রঞ্জক ক্যাটায়নকে স্ট্যাক করতে উৎসাহিত করে। ইথানল ও মিথানলের মতো অ্যালকোহল রিংগুলোকে ভালোভাবে দ্রবীভূত করে এবং অ্যাগ্রিগেট ভেঙে দেয়, তাই একই রঞ্জক ঘনত্ব পানির তুলনায় ইথানলে বেশি মনোমার-সদৃশ দেখায়। অ্যাপ্রোটিক কো-দ্রাবকও একই কাজ করে: 293 কেলভিনে পানি ও DMSO মিশ্রণে অতিরিক্ত DMSO ডাইমারাইজেশন কমিয়েছিল, যা স্ট্যাকিংয়ের চালক হিসেবে পানির গঠনের ভূমিকা নির্দেশ করে। সার্ফ্যাক্ট্যান্ট উভয় দিকেই সতর্কতা প্রয়োজন। তাদের ক্রিটিক্যাল মাইসেল ঘনত্বের উপরে, মাইসেল মনোমারকে আলাদাভাবে দ্রবীভূত করতে পারে এবং মনোমার-সদৃশ বর্ণালী ফিরিয়ে আনতে পারে। এর নিচে, বিপরীত চার্জযুক্ত সার্ফ্যাক্ট্যান্ট স্ট্যাকিং বাড়াতে পারে: 100 মাইক্রোমোলার রঞ্জকে SDS-চালিত পলিমারাইজেশন প্রায় 4 মিলিমোলার SDS-এ সর্বোচ্চ হয়েছিল, যা মাইসেল বিন্দুর প্রায় অর্ধেক, এরপর বেশি সার্ফ্যাক্ট্যান্টে পুনর্বণ্টন ঘটে। মিথিলিন ব্লু বর্ণালীতে রঞ্জক-দ্রাবক ও সংগঠিত মাধ্যমের প্রভাবের গবেষণা দেখায় যে তাৎক্ষণিক আণবিক পরিবেশ, শুধু মোট ঘনত্ব নয়, পর্যবেক্ষিত ব্যান্ড নির্ধারণ করে।

pH প্রধানত সীমার প্রান্তে গুরুত্বপূর্ণ। অধিকাংশ পরীক্ষাগারে ব্যবহৃত কাছাকাছি নিরপেক্ষ পরিসরে মিথিলিন ব্লু তার পরিচিত ক্যাটায়নিক নীল রূপে থাকে এবং অ্যাগ্রিগেশনই বর্ণালীর মূল বিষয়। শক্তিশালী অ্যাসিড বা ক্ষার, বর্ণহীন লিউকো রূপ তৈরি করা রেডক্স রসায়ন, অথবা প্রোটিন ও কণার সঙ্গে বন্ধন মনোমার-ডাইমার জোড়ার বাইরে অতিরিক্ত অবস্থা যোগ করে। বাফার যোগ করার পর বর্ণালী পরিবর্তিত হলে, সবকিছুকে শুধু pH-এর কারণে মনে করার আগে বাফারের লবণ ও বন্ধনকারী উপাদান পরীক্ষা করুন। রসায়ন ও প্রোটোনেশন রেফারেন্স এখানে আলোচিত অ্যাগ্রিগেশন প্রশ্ন থেকে পরিচয় সম্পর্কিত বিষয় আলাদা রাখে।

কেন Beer-Lambert সরলরেখা বাঁকে

Beer-Lambert সম্পর্ক বলে শোষণ = শোষণক্ষমতা × ঘনত্ব × পথ দৈর্ঘ্য। এটি একটি গণনা আইন। এটি ধরে নেয় যে গণনা করা বস্তুগুলো সংখ্যা পরিবর্তনের সঙ্গে একই থাকে: একটি শোষক প্রজাতি, স্থির বর্ণালী, ঘনত্বের সঙ্গে কোনো রাসায়নিক পরিবর্তন নেই, একবর্ণ আলো, কোনো বিচ্ছুরণ বা পুনঃনিঃসরণ নেই, এবং আলো প্রকৃতপক্ষে নির্ধারিত পথ অতিক্রম করে।

অ্যাগ্রিগেশন প্রথম অনুমানটি ভেঙে দেয়। আনুষ্ঠানিকভাবে মোট শোষণ এখনও প্রজাতি অনুযায়ী যোগফল: পথ দৈর্ঘ্য × প্রতিটি প্রজাতির শোষণক্ষমতা × তার নিজস্ব ঘনত্ব। প্রতিটি প্রজাতি আইন মেনে চলে। কিন্তু মিশ্রণ করে না, কারণ মোট রঞ্জকের ফাংশন হিসেবে প্রজাতির ঘনত্ব অরৈখিকভাবে পরিবর্তিত হয়। তাই মোট রঞ্জকের বিপরীতে মনোমার ব্যান্ডে শোষণের ক্যালিব্রেশন কার্ভ পাতলা সীমায় সরল থাকে এবং ঘনত্ব বাড়লে নিচের দিকে বাঁকে, কারণ প্রতিটি অতিরিক্ত অংশ তুলনামূলকভাবে কম মনোমার যোগ করে। ডাইমার ব্যান্ডে পড়া কার্ভ বিপরীত দিকে বাঁকে। অ্যাগ্রিগেশন গবেষণায় এই প্রক্রিয়াকেই পর্যবেক্ষিত Lambert-Beer বিচ্যুতির উৎস হিসেবে চিহ্নিত করা হয়েছে। বাঁকা অঞ্চলের মধ্য দিয়ে সরল রেখা ফিট করে তা প্রসারিত করা সাধারণ ভুল। রেখাটি শুধু সেই পরিসর ও ম্যাট্রিক্সে বৈধ যেখানে এটি তৈরি করা হয়েছে।

পাতলা করাও একই ধরনের ফাঁদ তৈরি করে। যন্ত্রের পরিসরে আনতে ঘন স্টককে পাতলা করলে প্রজাতির অনুপাত অপরিবর্তিত থাকে না। পাতলা করা কিউভেট আবার মনোমারের দিকে সাম্যাবস্থায় যায়, তাই এর বর্ণালী পাতলা নমুনাকে সঠিকভাবে বর্ণনা করে এবং স্টককে ভুলভাবে বর্ণনা করে। শোষণ স্কেল করে স্টকের বর্ণালী পুনর্গঠন করলে মোট পরিমাণের অনুমান কেবল তখনই ঠিক থাকে যখন ক্যালিব্রেশন পরিবর্তনটি অন্তর্ভুক্ত করে। এটি কখনো মূল ব্যান্ড আকৃতি ফিরিয়ে আনে না। ঘন দ্রবণের বর্ণালীকে পাতলা রেফারেন্সের সঙ্গে তুলনা করা মানে দুটি ভিন্ন মিশ্রণের তুলনা করা।

পথ দৈর্ঘ্য ফলাফলের অংশ

নমুনার মধ্য দিয়ে আলো যত দূর যায়, শোষণ তত বাড়ে। একই দ্রবণ ধারণকারী 10 mm কিউভেট 1 mm কিউভেটের তুলনায় দশগুণ শোষণ দেয়। এই স্কেলিং কেবল একই দ্রবণের জন্য সঠিক, এবং অ্যাগ্রিগেশন এই শর্তটিকে গুরুত্বপূর্ণ করে তোলে।

বাস্তবে, পথ দৈর্ঘ্য বৈধ পরিসরের মধ্যে থাকার একটি উপায়। দীর্ঘ পথ দৈর্ঘ্য পাতলা, প্রধানত মনোমারযুক্ত দ্রবণের সংবেদনশীলতা বাড়ায়। ছোট পথ দৈর্ঘ্য ঘন নমুনাকে বড় পাতলা ধাপ ছাড়াই পরিমাপযোগ্য রাখে, যা সাম্যাবস্থা পুনরায় সেট করতে পারে। উপরের সংখ্যাগুলোর পেছনের অ্যাগ্রিগেশন প্রোগ্রাম ঠিক এটাই করেছিল: 1.1 থেকে 34 মাইক্রোমোলার রঞ্জকের জন্য 1 সেন্টিমিটার সেল এবং 94 মাইক্রোমোলার থেকে 3.4 মিলিমোলারের জন্য 0.01 সেন্টিমিটার সেল। মাইক্রোভলিউম পেডেস্টাল ও প্লেট রিডার নিজস্ব জ্যামিতি যোগ করে, যেখানে ছোট ও কখনো পরিবর্তনশীল পথ এবং পৃষ্ঠ থাকে যেখানে ক্যাটায়নিক রঞ্জক শোষিত হতে পারে। সংখ্যার সঙ্গে পথ দৈর্ঘ্য রিপোর্ট করুন, যেমন বর্ণালী রেফারেন্স দ্রাবক ও লবণ রিপোর্ট করে। পথ দৈর্ঘ্য ছাড়া শোষণ কোনো ফলাফল নয়। এটি একটি অনুমান মাত্র।

এই প্রক্রিয়া থেকে পরিমাপের শৃঙ্খলা আসে। পাঠ নেওয়ার আগে নমুনাকে একই তাপমাত্রায় সাম্যাবস্থায় আনুন। একই ধরনের ও অবস্থানের কিউভেট, একই লবণ ও বাফার পটভূমিসহ মিলযুক্ত ব্ল্যাঙ্ক এবং পরিষ্কার কাচপাত্র ব্যবহার করুন, কারণ মিথিলিন ব্লু কাচ ও প্লাস্টিকে শোষিত হয় এবং দাগযুক্ত কিউভেট আগের ঘন নমুনার স্মৃতি বহন করে। অ্যাগ্রিগেশন গতিবিদ্যা গুরুত্বপূর্ণ হলে প্রস্তুতির পর দ্রুত পড়ুন, এবং অজানা নমুনার মতো একই ম্যাট্রিক্স ও একই পথ দৈর্ঘ্যে প্রতিটি ক্যালিব্রেশন কার্ভ তৈরি করুন। দৃশ্যমান পরীক্ষার জন্য মনে রাখুন, চোখ একটি দুর্বল স্পেকট্রোমিটার। দ্রবণের রঙ বিশুদ্ধতা প্রতিষ্ঠা করতে পারে কি না এটি আলাদা প্রশ্ন যার উত্তর নেতিবাচক, এবং অ্যাগ্রিগেশনের কারণে হওয়া বর্ণ পরিবর্তন এর একটি কারণ।

যন্ত্রের পাশে রাখার মতো একটি চিত্র

নিচের চিত্রটি নিবন্ধটিকে একটি বেঞ্চ রেফারেন্সে সংক্ষেপ করে। একই রঞ্জকযুক্ত তিনটি দ্রবণ রয়েছে, কিন্তু মোট ঘনত্ব ও লবণের পটভূমি ভিন্ন। তাদের পরিকল্পিত বর্ণালী দেখায় যে স্ট্যাকিং বাড়ার সঙ্গে দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের মনোমার ব্যান্ডের অংশ কমে ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ডাইমার ব্যান্ড বাড়ে। অবস্থাগুলো চিত্রে লেখা আছে, কারণ এগুলো ছাড়া কার্ভ পুনরায় ব্যবহার করা যায় না। নির্দিষ্ট অবস্থায় পরিমাপ করা ব্যান্ড অবস্থানের জন্য বর্ণালী রেফারেন্স ব্যবহার করুন। দ্রবণে প্রবেশের পর রঞ্জক কীভাবে কোষে প্রবেশ করে তার জন্য দেখুন রিডাকশন ও পার্টিশনিংয়ের মাধ্যমে কোষ প্রবেশ। আলো ডোজ ও জ্যামিতি কীভাবে ফটোকেমিক্যাল রিডআউটকে আরও প্রভাবিত করে তার জন্য দেখুন আলো এক্সপোজার ও পরিমাপ জ্যামিতি।

![ঘনত্ব এবং লবণ মিথিলিন ব্লুর বর্ণালীকে মনোমার থেকে ডাইমারের দিকে সরিয়ে দেয়। তিনটি লেবেলযুক্ত কিউভেট এবং তিনটি ওভারল্যাপ করা পরিকল্পিত বর্ণালী দেখায় যে ঘনত্ব ও আয়নিক শক্তি বাড়ার সঙ্গে দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ব্যান্ড ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ব্যান্ডের কাছে স্থান দেয়। প্যানেলে অবস্থা লেখা আছে।](/content-media/en/articles/methylene-blue-dimer-aggregation-absorption/media/concentration-spectrum-diagram