মিথিলিন ব্লু কি মাইটোকন্ড্রিয়াল Complex III বাইপাস করতে পারে? গবেষণাগুলো কেন ভিন্ন ফল দেখায়

দুটি গবেষণাগার পরীক্ষা করেছিল মিথিলিন ব্লু কি বাধাপ্রাপ্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল Complex III বাইপাস করতে পারে কিনা। একটির উত্তর ছিল না। অন্যটির উত্তর ছিল হ্যাঁ। উভয়ের কাছেই তথ্য ছিল।

প্রথম গবেষণায়, mouse brain mitochondria-তে দেখা যায় যে রঞ্জকটি তা করতে পারে না। দ্বিতীয় গবেষণায়, তিনটি rodent species-এর brain mitochondria-তে দেখা যায় যে এটি আংশিকভাবে পারে। তৃতীয় একটি গবেষণা, mouse liver-এ, প্রায়ই কাছাকাছি উল্লেখ করা হয় কিন্তু এটি ভিন্ন কিছু পরীক্ষা করেছিল। এটিকে যথাস্থানে রাখুন এবং বিভ্রান্তির অর্ধেক দূর হবে।

ঘোষণা করার মতো কোনো সর্বজনীন mechanism নেই। এখানে ভিন্ন blocker, dose এবং readout সহ তিনটি পরীক্ষা রয়েছে। আগে শর্তগুলো পড়ুন। তারপর উপসংহার অনুসরণ করুন।

এখানে bypass বলতে কী বোঝানো হয়েছে

ইলেকট্রন chain-এ প্রবেশ করে Complex I (NADH থেকে) অথবা Complex II (succinate থেকে), তারপর Complex III-এর মধ্য দিয়ে cytochrome c-তে এবং পরে Complex IV-এর মাধ্যমে oxygen-এ যায়। পথে তৈরি হওয়া gradient-ই কোষ ATP তৈরির জন্য ব্যবহার করে।

Bypass-এর দাবি হলো মিথিলিন ব্লু একটি block-এর upstream থেকে ইলেকট্রন গ্রহণ করে downstream-এ ছেড়ে দেয়। অক্সিডাইজড dye NADH বা chain-এর প্রাথমিক উপাদান থেকে ইলেকট্রন নেয়, leucomethylene blue-তে পরিণত হয়, এবং reduced form cytochrome c-তে বা আবার chain-এ ইলেকট্রন প্রদান করে। যদি এই handoff block-এর downstream-এ পৌঁছায়, respiration এবং membrane potential আংশিকভাবে পুনরুদ্ধার হয়। যদি এটি block-এর একই স্থানে বা upstream-এ পৌঁছায়, কিছুই পুনরুদ্ধার হয় না।

Complex III-এর একটি বিষয় এই বিতর্কের বড় অংশ নির্ধারণ করে। Complex-টি দুটি inhibitor site সহ Q cycle পরিচালনা করে। Antimycin Qi site-এ যুক্ত হয়। Myxothiazol Qo site-এ যুক্ত হয়। কোনো গবেষণায় শুধু একটি ব্যবহার করা হলে, তারা complex-এর মাত্র অর্ধেক পরীক্ষা করেছে।

গবেষণা এক: mouse brain mitochondria-তে bypass নেই

Gureev এবং সহকর্মীরা C57BL/6 mice-এর cortex mitochondria ব্যবহার করেন, digitonin দিয়ে isolated, 0.1 mg protein per ml-এ assay করা হয়। Substrate তিনটি regime-এ ছিল: প্রতিটি 5 mM pyruvate plus malate, 10 mM succinate সঙ্গে 2 mM glutamate, এবং 10 mM L-proline। Blocker ছিল 1 micromolar rotenone (Complex I) এবং 1 microgram per ml antimycin (Complex III)। Dye dose ছিল 0.5, 1, এবং 2 micromolar, যেখানে 1 micromolar ছিল প্রধান concentration। Methods এবং traces পাওয়া যাবে FEBS Letters communication-এ।

Complex I bypass কাজ করেছিল। Rotenone ADP stimulated respiration প্রায় 121 থেকে প্রায় 2 nmol per minute per mg-এ নামিয়ে দেয়, এবং 1 micromolar dye তা প্রায় 21-এ ফিরিয়ে আনে। Pyruvate plus malate এবং L-proline-এ membrane potential পুনরুদ্ধার হয়।

Complex III bypass কাজ করেনি। Antimycin respiration প্রায় 16-এ নামিয়ে দেয়, এবং dye তা মাত্র প্রায় 20-এ নিয়ে যায়। কোনো substrate-এ, dye dose 5 micromolar পর্যন্ত হলেও membrane potential পুনরুদ্ধার হয়নি। Peroxide data একই দিক নির্দেশ করে: dye একাই peroxide emission basal rate প্রায় 76 pmol per minute per mg থেকে প্রায় 1170, 1460 এবং 1945-এ বাড়ায়, তবুও antimycin সেই dye driven signal যথাক্রমে প্রায় 25, 88 এবং 96 শতাংশ কমিয়ে দেয়। যদি reduced dye সরাসরি oxygen-এর সঙ্গে বিক্রিয়া করত, Complex III block করলে signal কমার কথা নয়। লেখকেরা অনুমান করেন reduced dye Complex III-এর Qo site-এ oxidised হয়, antimycin block-এর upstream-এ। সংক্ষেপে: donor থেকে dye, dye থেকে Qo, তারপর স্বাভাবিক পথ। Rotenone bypass হয়। Antimycin হয় না।

গবেষণা দুই: তিন species-এ, উভয় inhibitor site-এ আংশিক bypass

Svab এবং সহকর্মীরা নকশাটি বিস্তৃত করেন। Mouse, rat এবং guinea pig-এর brain mitochondria, Percoll isolated, একই 0.1 mg per ml-এ assay করা হয়, pyruvate plus malate অথবা glutamate plus malate প্রতিটি 5 mM-এ। তারা দুটি Complex III blocker ব্যবহার করেন: 0.3 micromolar antimycin A এবং 1 micromolar myxothiazol। অধিকাংশ assay-এ dye ছিল 2 micromolar, cytochrome c কাজের জন্য 0.5। তিনটি species-এর একই protocol-এর তথ্য open access paper-এ রয়েছে।

তিনটি species-এই উভয় block আংশিকভাবে bypass হয়। Mouse mitochondria-তে antimycin respiration দমন করে এবং dye তা প্রায় 60 শতাংশ বাড়ায়, প্রায় 37 থেকে 59 nmol per minute per mg-এ। Myxothiazol তা 88 শতাংশ দমন করে প্রায় 4.5-এ নামায়, এবং dye পাঁচগুণ বাড়িয়ে প্রায় 23-এ নিয়ে যায়। Membrane potential উভয় inhibitor-এর ক্ষেত্রেই আংশিকভাবে repolarise হয়, দুটি dye (safranin O এবং ratiometric TMRM) দিয়ে মাপা হয় যাতে optical artefact বাদ দেওয়া যায়।

এই গবেষণায় handoff সরাসরি পরীক্ষা করা হয়েছিল, যা প্রথম গবেষণায় করা হয়নি। 25 micromolar exogenous acetylated cytochrome c inhibitor সহ বা ছাড়া energised mitochondria দ্বারা reduced হয়নি, কিন্তু dye যোগ করলে উভয় ক্ষেত্রেই reduction ঘটে। Cell free buffer-এ NADH plus dye cytochrome c-কে এমন হারে reduce করে যা NADH-এর অনুপাতে ছিল। সংক্ষেপে: reducing equivalents থেকে dye, dye সরাসরি cytochrome c-তে, Complex IV থেকে oxygen। এই route সম্পূর্ণভাবে Complex III এড়িয়ে যায়, তাই উভয় blocker bypass করা যায়।

আরও দুটি readout এই ব্যাখ্যাকে সমর্থন করে। Myxothiazol treated mitochondria-তে dye যোগ করার সময় NAD(P)H fluorescence কমে যায়, অর্থাৎ reducing equivalents নতুন route দিয়ে প্রবাহিত হয়। এবং 660 nm-এ dye absorbance প্রতিটি addition-এর সঙ্গে পরিবর্তিত হয়, যেখানে spun supernatants দেখায় energised mitochondria-এর ভিতরে oxidised dye একশ গুণেরও বেশি সমৃদ্ধ হয়, তারপর potential ভেঙে পড়লে বেরিয়ে যায়। Proton economics-ও সামঞ্জস্যপূর্ণ: pumping steps এড়ালে প্রতি electron pair-এ প্রায় 2 proton থাকে, 10-এর পরিবর্তে, তাই শুধু আংশিক repolarisation সহ দ্রুত oxygen ব্যবহারই প্রকৃত bypass-এর মতো দেখায়, এর বিরুদ্ধে প্রমাণ নয়।

একই preparation এমন প্রতিক্রিয়াও তৈরি করে যা সহজ পাঠকে বিভ্রান্ত করে। Inhibitor plus dye অবস্থায় ADP respiration বাড়ানোর পরিবর্তে কমিয়ে দেয়, এবং transport blockade ধীর করার পরিবর্তে তা উদ্দীপিত করে, যদিও membrane potential স্বাভাবিক দিকেই পরিবর্তিত হয়। এই system-এ শুধুমাত্র oxygen consumption বিভ্রান্তিকর।

গবেষণা তিন: liver গবেষণায় Complex I এবং II পরীক্ষা করা হয়েছিল, III নয়

Lee এবং Boelsterli mouse liver mitochondria এবং efavirenz (Complex I, IC50 প্রায় 30 micromolar) ও hydrazine, isoniazid metabolite (Complex II, IC50 প্রায় 30 micromolar)-এর কারণে ক্ষতিগ্রস্ত cultured hepatocytes ব্যবহার করেন। প্রায় 30 micromolar dye NADH oxidation, membrane potential এবং ATP পুনরুদ্ধার করে, একই সঙ্গে oxidants এবং necrotic death কমায়। Redox Biology paper এটিকে dye দ্বারা ক্ষতিগ্রস্ত Complexes I এবং II-এর চারপাশে electron বহনের মডেল হিসেবে উপস্থাপন করে।

এটি upstream context-এর প্রতিষ্ঠিত ফলাফল, এবং Complex III সম্পর্কে কিছু বলে না কারণ সেখানে কিছু block করা হয়নি। এটি কোনো brain study-কে নিশ্চিত বা খণ্ডন করতে পারে না।

শর্ত matrix

কেন উভয় Complex III গবেষণাই নিজেদের setup সম্পর্কে সঠিক হতে পারে

1. Blocker একই intervention ছিল না। Antimycin একাই 1 microgram per ml বনাম 0.3 micromolar antimycin plus একটি আলাদা Qo site blocker। Qo site-এ electron feed করা dye route ব্যর্থ হয় যেখানে সরাসরি cytochrome c route সফল হয়। একটি site দিয়ে উভয় site-এর প্রতিনিধিত্ব করা যায় না।

2. Dye dose এবং সময় আলাদা ছিল। 1 বনাম 2 micromolar-এর প্রধান concentration, এমন একটি redox cycler-এ যার uptake এবং direct cytochrome c reduction concentration ও সময়ের ওপর নির্ভরশীল। সামান্য dose পার্থক্য এবং ভিন্ন readout timing একই network-এর ভিন্ন অংশ প্রকাশ করতে পারে।

3. Preparation ভিন্ন ছিল। Digitonin isolation বনাম Percoll gradient isolation আংশিকভাবে একই কিন্তু সম্পূর্ণ অভিন্ন নয় এমন mitochondrial population নির্বাচন করে। Protein concentration 0.1 mg per ml-এ একই ছিল, তাই এই variable বাদ যায়, কিন্তু subpopulation এবং integrity বাদ যায় না। এবং সন্দেহভাজন species-এর বিষয়টি পরিষ্কার হয়: দ্বিতীয় group mouse-এও একই phenotype পুনরুৎপাদন করে।

4. Substrate state নির্ধারণ করে dye কী করতে পারে। তিনটি substrate regime বনাম NADH linked pairs। NADH supply এবং membrane potential একসঙ্গে নির্ধারণ করে dye কত দ্রুত reduced হয় এবং কোথায় partition করে, এবং reduced dye ও oxidised cytochrome c প্রয়োজন এমন route এই পছন্দের ওপর নির্ভরশীল।

পরবর্তী bypass claim কীভাবে পড়বেন

কোন complex block করা হয়েছে, কোন inhibitor, কোন site এবং কোন dose-এ তা জিজ্ঞাসা করুন। Dye concentration এবং readout কখন নেওয়া হয়েছে তা দেখুন। Tissue, species, isolation, protein concentration এবং substrate দেখুন। এবং দেখুন potential, respiration, redox state এবং direct handoff assay একমত কিনা, কারণ এখানে একাধিকবার শুধুমাত্র oxygen consumption ভুল দিক নির্দেশ করেছে।

সংক্ষিপ্ত সারাংশ একই থাকে। Complex I-এর চারপাশে dye bypass নিয়ে ঐকমত্য রয়েছে। Complex III-এর ক্ষেত্রে, antimycin 1 microgram per ml এবং dye 1 micromolar-এ mouse mitochondria কোনো functional bypass দেখায় না, যেখানে তিনটি species-এ antimycin 0.3 micromolar অথবা myxothiazol 1 micromolar এবং dye 2 micromolar ব্যবহার করলে direct dye to cytochrome c transfer সহ আংশিক bypass দেখা যায়। এই বাক্যগুলো একসঙ্গে সত্য হতে পারে। এর চেয়ে বিস্তৃত কোনো দাবি extrapolation।

সম্পর্কিত পাঠ্য বিতর্কিত দাবিকে প্রতিষ্ঠিত chemistry-এর মধ্যে রাখে: relay-এর জন্য how methylene blue moves electrons, প্রতিষ্ঠিত upstream case-এর জন্য the Complex I bypass experiments, দুটি dye কেন প্রয়োজন ছিল তা বোঝার জন্য membrane potential readouts and their artefacts, এবং dosing ও timing trap-এর জন্য redox cycler-এর laboratory handling।