নিবন্ধ
মিথিলিন ব্লু এবং ফেরোপটোসিস: আয়রন, লিপিড পেরঅক্সিডেশন, এবং কোষ মৃত্যু
ফেরোপটোসিস হলো ঝিল্লির ক্ষতির মাধ্যমে কোষ মৃত্যু। ঝিল্লির পলিআনস্যাচুরেটেড চর্বি শৃঙ্খল বিক্রিয়ায় অক্সিডাইজ হয়, ঝিল্লি অকার্যকর হয়ে যায় এবং কোষ মারা যায়। এই রাসায়নিক প্রক্রিয়ার জন্য আয়রন প্রয়োজন। এই বাক্যটিই পুরো ধারণার সারাংশ, এবং এই নিবন্ধের সবকিছু এর একটি অংশ পরীক্ষা করে।
এখানে প্রশ্নটি আরও নির্দিষ্ট: কোষ পরীক্ষায় মিথিলিন ব্লু সেই শৃঙ্খলে কী পরিবর্তন আনে এবং সেই ফলাফল প্রকৃতপক্ষে কী দেখায়। সংক্ষিপ্ত উত্তর হলো, দুটি পরীক্ষাগার গবেষণায় ন্যানোমোলার মিথিলিন ব্লু মাইটোকন্ড্রিয়াল লিপিড পেরঅক্সিডেশন কমিয়েছে এবং এমন উদ্দীপকের পরেও কোষকে জীবিত রেখেছে যা সাধারণত ফেরোপটোসিস ঘটায়। দীর্ঘ উত্তরটি বেশি গুরুত্বপূর্ণ, কারণ শৃঙ্খলের প্রতিটি সংযোগ আলাদা হস্তক্ষেপের মাধ্যমে পরীক্ষা করা হয়েছে এবং প্রতিটি হস্তক্ষেপের সীমাবদ্ধতা রয়েছে।
এক অনুচ্ছেদে ফেরোপটোসিস
একটি মেমব্রেন ফসফোলিপিড, যার সঙ্গে একটি পলিআনস্যাচুরেটেড ফ্যাটি অ্যাসিড লেজ যুক্ত থাকে, তার একটি দুর্বল স্থান থাকে: এমন হাইড্রোজেন পরমাণু যা সহজে অপসারিত হয়। কোনো র্যাডিক্যাল একটি চুরি করলে, অক্সিজেন লিপিডের সঙ্গে যুক্ত হয়, একটি লিপিড পেরঅক্সিল র্যাডিক্যাল তৈরি হয় এবং সেই র্যাডিক্যাল পরবর্তী লিপিড থেকে চুরি করে। কোনো কিছু এই প্রক্রিয়া থামানো না পর্যন্ত বিক্রিয়াটি ঝিল্লি জুড়ে চলতে থাকে।
প্রধান প্রতিরোধ সংকেত হলো GPX4 নামের একটি এনজাইম, যা গ্লুটাথায়োন ব্যবহার করে লিপিড পারঅক্সাইডকে ক্ষতিকর নয় এমন লিপিড অ্যালকোহলে রূপান্তর করে। পরীক্ষাগারের উদ্দীপকগুলো এই প্রতিরক্ষাকে নির্দিষ্ট স্থানে আক্রমণ করে। Erastin system xc-minus-এর মাধ্যমে সিস্টিন আমদানি বন্ধ করে, ফলে গ্লুটাথায়োন সংশ্লেষণের জন্য কোষে সিস্টেইনের ঘাটতি হয়। Buthionine sulfoximine সরাসরি গ্লুটাথায়োন সংশ্লেষণ বন্ধ করে। RSL3 নিজেই GPX4 নিষ্ক্রিয় করে। তিনটিই অপসারণ না হওয়া পারঅক্সাইড রেখে যায়, কিন্তু তারা ভিন্ন ধাপে কাজ করে, তাই একটি উদ্দীপকের ফলাফল স্বয়ংক্রিয়ভাবে অন্যগুলোর ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য নয়।
যে বৈশিষ্ট্যগুলো এটিকে সংজ্ঞায়িত করে সেগুলোর দিক থেকে ফেরোপটোসিস অ্যাপোপটোসিস থেকে আলাদা। এখানে কোনো ক্যাসপেস ক্যাসকেড নেই এবং কোনো অ্যাপোপটোটিক বডি নেই। Deferoxamine-এর মতো আয়রন চিলেটর এবং ferrostatin-1-এর মতো র্যাডিক্যাল-ট্র্যাপিং এজেন্ট এটি দমন করে, যা গবেষকেরা ব্যবহার করেন কোনো কোষ মৃত্যু ফেরোপটোটিক নাকি কেবল নেক্রোটিক তা নির্ধারণের কার্যকর পরীক্ষা হিসেবে। নিয়ন্ত্রিত কোষ মৃত্যুর পথগুলোর বিস্তৃত প্রেক্ষাপট এই পার্থক্যটি বোঝাতে সাহায্য করে, এবং কোষ কীভাবে ল্যাবাইল আয়রন পরিচালনা করে তা ব্যাখ্যা করে কেন চিলেশন এত গুরুত্বপূর্ণ নিয়ন্ত্রণ।
মাইটোকন্ড্রিয়ার ভূমিকা এবং কেন এটি বিতর্কিত ছিল
প্রাথমিক গবেষণায় দেখা গিয়েছিল যে মাইটোকন্ড্রিয়াল DNA ছাড়া কোষও ফেরোপটোসিসের মধ্য দিয়ে যেতে পারে, যা ইঙ্গিত দেয় যে মাইটোকন্ড্রিয়া অপরিহার্য নয়। পরবর্তী গবেষণায় দেখা যায়, মাইটোকন্ড্রিয়া অপসারণ বা শ্বসন বন্ধ করা সিস্টিনের ঘাটতি থেকে হওয়া ফেরোপটোসিস কমাতে পারে, কিন্তু সরাসরি GPX4 নিষ্ক্রিয়তা থেকে হওয়া ফেরোপটোসিসে তা কাজ করে না। উভয় ফলাফলই সত্য হতে পারে, যদি মাইটোকন্ড্রিয়ার অবদান উদ্দীপক, কোষের ধরন এবং কোথায় চূড়ান্ত পেরঅক্সিডেশন ঘটে তার ওপর নির্ভর করে।
এই নিবন্ধের মূল গবেষণাটি একটি কম্পার্টমেন্ট-নির্দিষ্ট প্রোব দিয়ে এই বিতর্কের কাছে যায়। MitoCLox হলো লিপিড পেরঅক্সিডেশন রিপোর্টারের একটি মাইটোকন্ড্রিয়া-লক্ষ্যযুক্ত সংস্করণ: এটি মাইটোকন্ড্রিয়ার ভিতরে লিপিড পেরঅক্সিল র্যাডিক্যালের সংস্পর্শে এলে ফ্লুরোসেন্স পরিবর্তন করে। Erastin দিয়ে চিকিৎসা করা ফাইব্রোব্লাস্টে, মৃত্যুর আগে জীবিত কোষেই মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোব অক্সিডেশন দেখা যায় এবং এটি কোষসমষ্টির মধ্যে ভিন্ন ছিল। সময়টি গুরুত্বপূর্ণ। মৃত্যুর আগে হওয়া পেরঅক্সিডেশন সম্ভাব্য কারণ। কেবল মৃত কোষে মাপা পেরঅক্সিডেশন হলো ধ্বংসাবশেষ। লিপিড পেরঅক্সিডেশন অ্যাসে এবং প্রতিটি প্রোব কী রিপোর্ট করে বিষয়ে সহায়ক নির্দেশিকায় ব্যাখ্যা করা হয়েছে কেন প্রোবের অবস্থান সংকেতের অর্থ নির্ধারণ করে।
একই ধরণ দ্বিতীয় মডেলেও দেখা যায়। Leber hereditary optic neuropathy রোগীর ফাইব্রোব্লাস্ট, যাদের complex I মিউটেশন এবং বেশি বেসলাইন অক্সিডেটিভ স্ট্রেস রয়েছে, গ্লুটাথায়োন কমে গেলে ফেরোপটোসিসের মাধ্যমে মারা যায়, যেখানে নিয়ন্ত্রণ ফাইব্রোব্লাস্ট প্রতিরোধ করে। আবারও মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোব অক্সিডেশন আগে দেখা যায়। বিস্তারিত ফেরোপটোসিসে মাইটোকন্ড্রিয়াল লিপিড পেরঅক্সিডেশনের ফাইব্রোব্লাস্ট গবেষণায় রয়েছে।
এই পরীক্ষাগুলোতে মিথিলিন ব্লু কী পরিবর্তন করেছে
মিথিলিন ব্লু একটি রেডক্স বাহক। এর অক্সিডাইজড রূপ NADH-সংযুক্ত রাসায়নিক প্রক্রিয়া থেকে complex I-এ ইলেকট্রন গ্রহণ করে এবং এর রিডিউসড রূপ cytochrome c-এ ইলেকট্রন প্রদান করে, যা complex IV-এ প্রবাহিত হয়। এর ফলে শৃঙ্খলের সেই অংশের চারপাশে আংশিক বাইপাস তৈরি হয় যেখানে সাধারণত ইলেকট্রন অক্সিজেনের কাছে লিক হয়ে superoxide তৈরি করে। সম্পূর্ণ রিলে চিত্র বুঝতে আগ্রহী পাঠকেরা মাইটোকন্ড্রিয়ার মাধ্যমে মিথিলিন ব্লু কীভাবে ইলেকট্রন সরায় দিয়ে শুরু করতে পারেন।
Erastin-চিকিৎসা করা lung fibroblast-এ, 250 nanomolar মিথিলিন ব্লু একটি কোষ বেঁচে থাকার পরীক্ষায় viability বজায় রেখেছিল, পাশাপাশি মাইটোকন্ড্রিয়া-লক্ষ্যযুক্ত অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট SkQ1 এবং MitoTEMPO-ও একই কাজ করেছিল। নিয়ন্ত্রণগুলো দাবির সীমা নির্ধারণ করে। Ferrostatin-1, alpha-tocopherol এবং deferoxamine-ও সুরক্ষা দিয়েছে, যা নিশ্চিত করে যে কোষ মৃত্যুটি ফেরোপটোটিক ছিল। অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট গ্রুপ ছাড়া SkQ1 analog সুরক্ষা দেয়নি, যা অ-নির্দিষ্ট জমার পরিবর্তে রেডক্স রাসায়নিক প্রক্রিয়ার দিকে নির্দেশ করে। প্রায় 200 nanomolar-এর বেশি SkQ1-এ সুরক্ষা কমে যায়, যা বেশি মাত্রায় quinone অ্যান্টিঅক্সিডেন্টের পরিচিত pro-oxidant আচরণের সঙ্গে সামঞ্জস্যপূর্ণ। মিথিলিন ব্লুরও একই ধরনের দ্বিমুখী মাত্রা-নির্ভর আচরণ রয়েছে, এই পরীক্ষাগারে কম nanomolar স্তরে সুরক্ষামূলক এবং বেশি মাত্রায় বা শক্তিশালী আলোতে redox cycling-এর মাধ্যমে hydrogen peroxide তৈরি করতে সক্ষম। এই ধরনের মাত্রার প্রেক্ষাপট মাইটোকন্ড্রিয়ায় reactive oxygen species বিষয়ে আলোচিত হয়েছে।
এরপর বিচ্ছিন্ন-মাইটোকন্ড্রিয়া পরীক্ষাগুলো ROS-এর উৎস আলাদা করেছে। Ferrous iron উপস্থিত থাকলে, complex I-এ প্রবাহিত substrate এবং rotenone প্রোব অক্সিডেশন বাড়ায়। Rotenone flavin site-এর পরের অংশে বাধা দেয়, ফলে উপরের carrier-গুলো reduced থাকে এবং matrix-মুখী flavin থেকে অক্সিজেনে ইলেকট্রন লিক হয়। Complex III-এ প্রবাহিত substrate এবং antimycin A প্রচুর hydrogen peroxide তৈরি করে, কিন্তু লিপিড পেরঅক্সিডেশন ঘটায় না। একই মোট ROS সংকেত, ভিন্ন অবস্থান, ভিন্ন ফলাফল। SkQ1 এবং মিথিলিন ব্লু উভয়ই hydrogen peroxide উৎপাদন বন্ধ না করেই complex I-চালিত পেরঅক্সিডেশন কমিয়েছে, যা দেখায় যে তাদের কার্যপ্রক্রিয়া ROS তৈরির পরের ধাপে, লিপিড পেরঅক্সিডেশন পর্যায়ে।
আয়রন ওভারলোড অংশ এবং lipofuscin সংকেত
দ্বিতীয় একটি গবেষণা প্রশ্নটি আয়রনের দিক থেকে দেখেছে। Submillimolar ferric ammonium citrate-এর সংস্পর্শে আসা H9c2 cardiomyocytes-এ মাইটোকন্ড্রিয়াল ROS, মাইটোকন্ড্রিয়াল লিপিড পেরঅক্সিডেশন, তারপর ফেরোপটোসিস এবং 24 ঘণ্টার মধ্যে lipofuscin-এর মতো রঞ্জক জমা দেখা যায়। Lipofuscin হলো অক্সিডাইজড লিপিড ও প্রোটিনের লোহা-যুক্ত, autofluorescent অবশিষ্টাংশ যা বয়সের সঙ্গে জমা হয়, এবং এখানে এর দ্রুত উপস্থিতি তীব্র আয়রন-চালিত পেরঅক্সিডেশনকে একটি পরিচিত aging marker-এর সঙ্গে যুক্ত করে। Nanomolar মিথিলিন ব্লু এবং SkQ1 উভয়ই পেরঅক্সিডেশন, কোষ মৃত্যু এবং রঞ্জক জমা প্রতিরোধ করেছে। বিচ্ছিন্ন cardiac mitochondria একই ধরণ নিশ্চিত করেছে: rotenone এবং ferrous iron পেরঅক্সিডেশন ও রঞ্জক-সদৃশ সংকেত বাড়িয়েছে এবং উভয় এজেন্ট তা বন্ধ করেছে। সম্পূর্ণ ক্রমটি H9c2 cardiomyocytes-এ iron overload গবেষণায় রিপোর্ট করা হয়েছে। রঞ্জকের দিকটি lipofuscin এবং cellular aging markers বিষয়ে আলোচিত হয়েছে।
কোষ বেঁচে থাকার পরীক্ষা যা দেখায় না
CellTiterBlue-এর মতো viability readout দেখায় কোনো উদ্দীপক এবং সম্ভাব্য সুরক্ষাকারীর সংমিশ্রণের পর একটি পাত্রে কতগুলো কোষ বিপাকীয়ভাবে সক্রিয় থাকে। এটি একটি নির্দিষ্ট ব্যবস্থায় একটি প্রক্রিয়ার পরীক্ষা। এটি চিকিৎসার ফলাফল নয়। এই পরীক্ষাগুলোর কোনোটি কোনো রোগীকে dose দেয়নি, কোনো রোগের endpoint মাপেনি বা শরীরের মধ্যে therapeutic window নির্ধারণ করেনি।
চারটি সীমাবদ্ধতা স্পষ্টভাবে উল্লেখ করা প্রয়োজন। প্রথমত, কোষের ধরন সীমিত: transformed lung fibroblast, একটি mitochondrial disease line-সহ primary skin fibroblast, এবং rat cardiomyocyte line, পাশাপাশি বিচ্ছিন্ন rat heart mitochondria। বিভিন্ন line-এর সংবেদনশীলতা ভিন্ন ছিল, এবং LHON line পরিকল্পিতভাবেই বেশি দুর্বল ছিল। দ্বিতীয়ত, উদ্দীপকগুলো পরীক্ষাগারের চরম অবস্থা: সম্পূর্ণ transport blockade বা synthesis blockade এবং এমন আয়রন মাত্রা যা কোনো টিস্যুতে হঠাৎ দেখা যায় না। তৃতীয়ত, concentration সরাসরি গুণ করে রূপান্তর করা যায় না। Culture medium-এ