Статия
Оцветяване с метиленово синьо: микроскопски методи и атлас с реални изображения
Оцветяването с метиленово синьо улеснява различаването на иначе слабо видими клетъчни особености при светлополева микроскопия. То може да помогне на учащите да открият ядрото на клетка от вътрешната страна на бузата или да разгледат очертанията и разположението на микроорганизми. Синият обект обаче е наблюдение. Определянето на организма, измерването му и преценката дали той е признак за заболяване са отделни задачи.
Изображението на корицата илюстрира принципа на контраста. Атласът по-долу съдържа реални снимки на независимо документирани образци, заедно с информацията от оригиналните им източници.
Какво разкрива метиленовото синьо?
Метиленовото синьо е основно багрило: оцветеният му йон носи положителен заряд. Както OpenStax обяснява в раздела си за оцветяване на образци, основните багрила взаимодействат с отрицателно зареден клетъчен материал и могат да откроят клетките на по-светъл фон. В подходящи препарати метиленовото синьо подчертава области, богати на нуклеинови киселини, и други структури, които свързват багрилото.
При простото оцветяване контрастът се осигурява от едно багрило. Затова различни организми могат да изглеждат сини, без да са един и същ организъм. Полезните въпроси в началото са описателни: обектите кръгли ли са или удължени, единични ли са или групирани, равномерно ли са оцветени или във вътрешността им се различават структури? Вижте разликата между простото оцветяване и оцветяването по Грам, преди да тълкувате цвета като резултат от класификация.
Контрастът и разделителната способност са различни неща. Контрастът помага да се различи обектът от обкръжението му; разделителната способност позволява да се разграничат близко разположени детайли. По-тъмното изображение не гарантира, че се различават повече структури. Нито всяка тъмна гранула трябва да се определя като органел.
Нативни препарати, оцветени влажни препарати и натривки
Неоцветеният, или нативен, влажен препарат позволява наблюдение без добавено багрило, въпреки че изваждането от първоначалната среда все пак променя образеца. При оцветения влажен препарат се добавя реагент, докато материалът остава в течност под покривно стъкло. При фиксираната натривка материалът се разстила върху предметно стъкло и преди последващата обработка се прилага определен метод на фиксация. Обзорът на OpenStax за подготовката на препарати разграничава влажните препарати от фиксацията и обяснява защо фиксираните организми вече не позволяват наблюдение на нормалното движение или метаболизъм.
Тези препарати отговарят на различни въпроси:
| Препарат | Полезно наблюдение | Какво изображението не може да установи самостоятелно |
|---|---|---|
| Нативен влажен препарат | Движение, очертания, естествено видим материал | Идентичност само въз основа на движение или форма |
| Оцветен влажен препарат | Контраст между структурите, които свързват багрилото, и обкръжението им | Дали реагентът е оставил нормалната физиология непроменена |
| Фиксирана, оцветена натривка | Морфология, запазена след определена подготовка | Как се е държал първоначалният жив образец |
| Конкретен диференциален метод | Определена реакция на оцветяване с подходящи контроли | Видова идентичност или диагноза без останалите доказателства, изисквани от метода |
За сравнение в учебни условия документирайте неоцветен препарат, преди да разгледате отделен оцветен препарат, изготвен според учебния протокол. Поддържайте съпоставими настройки за осветяване и заснемане. Ако са снимани две различни клетки, описвайте ги като примери, а не като запис на една клетка преди и след оцветяването.
Микроскопски атлас: три реални оцветени образеца
Този атлас представлява оригинален подбор и интерпретация на три микрофотографии с отворен лиценз. Авторите на източниците посочват образците и багрилата. Не сме проверили независимо идентичността на техните образци. Изображенията са възпроизведени без изрязване, чрез преобразуване във WebP без загуба на качество, без добавени детайли или промени в цветовете.
Табло 1: човешки клетки от вътрешната страна на бузата
Образец: човешки клетки от вътрешната страна на бузата. Багрило: метиленово синьо. Увеличение: 400×, посочено от фотографа. Мащабна скала: липсва; източникът не предоставя калибриран размер на пиксела. Снимка от Fritzmann2002, 2017, от Човешки клетки от вътрешната страна на бузата (оцветяване с метиленово синьо), с лиценз CC BY-SA 4.0. Това възпроизвеждане запазва същия лиценз.
.jpg){kind=link}
Започнете с отделна клетка: по-тъмното ѝ ядро се различава по-лесно от заобикалящата го синя цитоплазма. След това разгледайте припокриващите се клетки под нея. Припокриването затруднява проследяването на границата и може да създаде локално по-тъмна област. Използвайте това табло, за да упражнявате проследяването на очертания, а не да броите всяко тъмно петно като ядро. Ръководството за наблюдение на клетки от вътрешната страна на бузата развива упражнението за този конкретен тип проба.
Табло 2: клетки от лук
Образец: клетки от лук, според идентификацията в източника. Багрило: метиленово синьо. Увеличение: „200x“ фигурира в оригиналното име на файла; не е независимо потвърдено. Мащабна скала: липсва; не е предоставена калибрация. Снимка от Alvy16, 2019, от Клетка от лук 200x, с лиценз CC BY 4.0.
Удължените отделения образуват подреден слой. Сравнете дългите им общи граници с неправилните очертания в Табло 1. Обърнете внимание и на ясно забележимия тъмен материал и неравномерната яркост на зрителното поле. Снимката не установява какво представлява всяко тъмно отлагане. Тя показва защо полезният запис на наблюденията включва артефакти и неопределеност, вместо да обозначава всичко, което се оцветява.
Табло 3: дрожди, идентифицирани от източника като Candida spp.
Образец: Candida spp., според фотографа. Багрило: просто позитивно оцветяване с метиленово синьо. Увеличение: не е посочено. Мащабна скала: липсва; не е предоставен калибриран размер на пиксела. Снимка от Marta, потребител на Wikimedia с име Martunia.g, 2021, от Позитивно оцветяване с метиленово синьо 2, с лиценз CC BY 4.0.
Сравнете плътните сини струпвания с по-слабо наситените с обекти периферни области. Отделните очертания се проследяват по-лесно там, където обектите се припокриват по-малко. Името Candida идва от описанието в източника, а не от видова идентификация, извършена по тази снимка. Това табло не предоставя и резултат за жизнеспособност. Тестовете за жизнеспособност и дишане на дрожди изискват собствени условия, контроли и интерпретация.
Правилно разчитане на мащаба
Тези табла позволяват визуално сравнение, но не и измервания в микрометри или сравнения на абсолютния размер на клетките между отделните табла. Посоченото увеличение не възстановява липсващата калибрация на камерата. Промяната на размера, с който се показва изображението, променя видимото му увеличение.
За собствените си изображения извършете калибрация за измерване, като използвате известен еталон и съответната оптична конфигурация. Ръководството на Nikon за микрометрия обяснява как предметният микрометър преобразува произволните деления на изображението или окулярната скала във физически дължини. Запишете обектива, конфигурацията на камерата и калибрацията и добавете мащабна скала въз основа на тези данни. Не определяйте скалата по среден размер на клетка, посочен в учебник.
Съответства ли съдържанието на бутилката на метода?
Бутилка с етикет „метиленово синьо“ не представлява пълна лабораторна спецификация. Проверете концентрацията и мерните единици, разтворителя, допълнителните съставки, предназначението, документацията за партидата и инструкциите. Информационният лист за безопасност на реагента описва опасностите; инструкциите за метода определят как да го използвате за предвидения препарат.
Конкретен пример е разтворът на метиленово синьо по Льофлер на Merck. Производителят го определя като реагент за микроскопия и описва ролята му като контрастно багрило при оцветяване за киселинна устойчивост. Посочената му запалимост също показва защо „синя течност“ е недостатъчна информация за планиране на работа или нагряване. Тези свойства се отнасят за конкретния състав, а не автоматично за всеки воден разтвор на метиленово синьо.
По същия начин агарът с еозин и метиленово синьо е хранителна среда с определен състав. Той не е оцветител за микроскопски препарати, получен чрез добавяне само на метиленово синьо към образец. Ако целта на микроскопското изобразяване е друга, сравнете алтернативите на метиленовото синьо за микроскопия.
При комплект с микроскоп за начинаещи започнете с документирания му учебен метод, готови препарати с известно съдържание и посочения реагент. Ако бутилката е останала без етикет или съставът ѝ не може да бъде установен, заменете я с подходящия документиран реагент. Използвайте защита за очите и следвайте инструкциите за работа, предоставени за конкретния състав. Човешкият материал и неизвестните проби от околната среда изискват процедурите на учебната лаборатория за работа с проби и изхвърлянето им; оцветяването не замества тези процедури.
Запишете наблюдението преди заключението
„Сини овални обекти в струпвания“ е обосновано описание на изображение. „Конкретна инфекция“ изисква доказателства, които изображението не е предоставило. Записвайте поотделно в лабораторния дневник произхода на образеца, подготовката, реакцията на оцветяване и метода за идентификация. Това разграничение прави простото изображение от учебно занятие полезно и не позволява привлекателна микрофотография да бъде използвана в подкрепа на твърдение, което тя не може да докаже.