Метиленово синьо и левкометиленово синьо: една редокс двойка, два цвята

Студентка добавя няколко капки синьо багрило в колба, завърта я и наблюдава как цветът изчезва. Разклаща колбата и синьото се връща. Между двете състояния нищо не е добавено или отстранено, освен електрони и контакт с въздуха. В тази колба се съдържа цялата тема на статията: метиленовото синьо и неговият редуциран партньор, левкометиленовото синьо, които се превръщат едно в друго като обратима редокс двойка, а цветът показва резултата.

Практическият извод е на първо място. Тук промяната на цвета не е страничен ефект. Тя е аналитичният сигнал. Всеки, който разработва формулации с метиленово синьо, титрува с него или го използва в обучението, трябва да може да напише полуреакцията по памет, да посочи условията, които я насочват наляво или надясно, и да назове примесите, които правят резултата неясен.

Двойката в едно уравнение

Окисленото метиленово синьо е метилтиониниевият катион: плоска фенотиазиниева система със сяра и азот в централния пръстен и диметиламиногрупа във всеки край, доставяна като хлоридна сол. PubChem го регистрира като метилтиониниев хлорид, C.I. Basic Blue 9. Във вода мономерът поглъща светлина около 664 nm, което обуславя синия цвят, възприеман от окото.

Редуцираното левкометиленово синьо (LMB) има същия скелет, но азотът в централния пръстен е протониран, а хромофорът е нарушен. При близко до неутралното pH то е без заряд и почти безцветно, с пренебрежимо поглъщане във видимата област и силна ултравиолетова ивица около 258 nm (запис в PubChem за левкометиленово синьо, CAS 613-11-6). Броят на протоните в полуреакцията зависи от pH, защото редуцираната форма се протонира в кисела среда (приблизителни стойности на pKa около 4.5 и 5.8). Три режима обхващат практическия диапазон:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, синьо <=> безцветно (близко до неутралното pH, 1 протон)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), синьо <=> безцветно (умерено кисела среда, 2 протона)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> двойно протонирана левкоформа (силно кисела среда, 3 протона)

И трите записа описват една и съща двойка при различни състояния на протониране — въпрос, който литературата за редокс поведението на тиазиновите багрила разглежда систематично. Зависимостта от pH следва уравнението на Нернст за Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, като дава наклон около 29.6, 59.2 или 88.7 mV на единица pH за m = 1, 2 или 3. Измерените наклони около 28, 58 и 87 mV на единица pH потвърждават това съответствие, така че посочен потенциал без съответното pH е безсмислен.

Какво казва уравнението на разработчика на формулации

От стехиометрията следват три факта. Първо, два електрона на молекула означава, че в сумарната си реакция метиленовото синьо е двуелектронен индикатор и медиатор, а не едноелектронен преносител. Второ, участват протони, така че формалният потенциал се променя с pH, както е описано по-горе. Трето, формалният потенциал при pH 7 е около +0.011 V спрямо стандартния водороден електрод (около +0.53 V при pH 0), което поставя двойката сред умерените окислители: достатъчно силна, за да приема електрони от добри донори като NAD(P)H или аскорбат, и достатъчно слаба, за да ги отдава на разтворен кислород или центрове с тривалентно желязо. Именно тази междинна позиция позволява на багрилото да преминава циклично между двете форми, вместо да остава в едната.

Концентрацията добавя още една особеност. Над приблизително сто микромолара във вода, в съответствие с публикувана константа на дисоциация на димера до мономери около 170 до 250 uM при pH 7, окисленият катион се подрежда в димери и по-големи агрегати с изместена ивица на поглъщане около 610 до 615 nm. Следователно спектър с отклонение от очаквания пик може да означава агрегация, а не примес. Първо разредете, после преценете.

Условия, които насочват процеса във всяка посока

Таблицата по-долу е справочник за работа в лабораторията. Редукцията изисква донор на електрони; повторното окисление изисква акцептор на електрони и обикновено въздухът е достатъчен.

Всеки ред следва едно и също уравнение. Променя се само движещата сила. В този смисъл двойката е обратима: пътят е един и същ, но се изминава в противоположни посоки при противоположни условия.

Обяснение на „синята бутилка“

Механизмът на тази демонстрация заслужава ясно обяснение, защото тя представя двойката в миниатюра. В алкален разтвор на глюкоза основата подпомага енолизацията на глюкозата, а полученият ендиолат редуцира метиленовото синьо до левкометиленово синьо, така че разтворът в колбата става безцветен. Разклащането разтваря кислород от газовото пространство над течността, кислородът окислява отново левкоформата и синият цвят се връща. При покой разтвореният кислород се изчерпва в реакционната зона близо до повърхността и глюкозата отново надделява. Цикълът се повтаря, докато глюкозата се изразходва, а всяко разклащане е видима демонстрация на уравнението на Нернст: повишете активността на окислителя и равновесието се измества към синьото.

Радикалът по средата

Сумарната реакция пренася два електрона, но елементарните стъпки пренасят по един. Между синия катион и безцветната левкоформа стои семихинонов радикалов междинен продукт, който предимно диспропорционира обратно до двете форми, вместо да се натрупва. Неговият едноелектронен потенциал около минус 0.23 V при pH 7 е далеч под средния потенциал на сумарната двуелектронна реакция, затова радикалът остава в ниска концентрация в стационарно състояние. Той е важен по две причини. При осветяване багрилото достига възбудени състояния, които отварят радикалови пътища — затова разтворите на метиленово синьо са чувствителни към светлина и фотохимията трябва да присъства във всеки протокол за стабилност. А при висока концентрация окислената форма се димеризира, което променя спектъра и привидната кинетика, без да променя самата двойка. Нито един от тези факти не нарушава обратимостта. И двата обясняват наблюдения, които иначе изглеждат като необратимост.

Деметилираните сродни съединения изместват скалата

Отстранете метилови групи от двете диметиламинови разклонения и двойката се запазва, но с променени свойства. Максимумът на поглъщане се измества последователно към синия край на спектъра при всяко деметилиране: метиленово синьо около 664 nm, Azure B около 654, Azure A около 630, Azure C около 615 и тионин около 600 nm. Azure B, при който липсва една метилова група, е най-близкото сродно съединение: основен метаболит на метиленовото синьо и документиран примес в суровината метиленово синьо. Azure A и Azure C продължават редицата със същия редокс-активен скелет. Тионинът, при който и двете аминогрупи са напълно деметилирани, е в края на редицата с формален потенциал около +0.06 V при pH 7 спрямо +0.011 V за метиленовото синьо и се редуцира осезаемо по-лесно. Редокс потенциалите в редицата зависят от средата и електрода, затова сравнявайте стойности само при еднакви условия. Ето защо профилирането на примесите е редокс въпрос, а не просто отметка за чистота. Няколко процента Azure B означават няколко процента от различна редокс двойка в бутилката, а Azure B като примес и метаболит описва как се контролира този дял.

Къде се включва биологията

В еритроцита NADPH редуцира метиленовото синьо до левкометиленово синьо, а левкоформата предава електрони на тривалентното желязо в хема, възстановявайки двувалентното състояние на желязото в хемоглобина. Този единствен механизъм на предаване на електрони е химичната основа за употребата на метиленово синьо при придобита метхемоглобинемия. Всичко след този пренос — енергийният метаболизъм, митохондриалният поток на електрони и всякакви биологични резултати — принадлежи към темата за митохондриалния електронен транспорт и умишлено е оставено там.

Купувайте двойката, а не само цвета

Качеството на едно редокс багрило зависи от неговата спецификация. Високата чистота е важна, защото метиленовото синьо, което не отговаря на USP, обикновено е с текстилно качество и съдържа Azure B, тежки метали или остатъчни разтворители. Те променят редокс измерванията и правят крайните точки неясни, а никой протокол за оцветяване не проверява за тях. Повечето продавачи, които заявяват съответствие с USP, изследват само тежките метали и обявяват успех. Пълното съответствие обхваща идентичност, количествено определяне, органични примеси, остатъчни разтворители, елементни примеси, остатък след накаляване, микробиологични граници и бактериални ендотоксини, а как да изберете метиленово синьо с фармацевтично качество обяснява как да се разчита тази документация. Blupreme работи с фармацевтичен производител на метиленово синьо, извършва изпитвания по пълната спецификация на USP и публикува пълния сертификат за анализ (COA). Когато цветът е измерването, тази документация е част от измервателния инструмент.