Как метиленовото синьо навлиза в клетките: редукция, реоксидация и разпределение в мембраната

Ако наблюдавате как ендотелни клетки в лабораторен съд поемат метиленово синьо, очевидното обяснение се оказва и погрешното. Средата губи синия си цвят, а в клетките се появяват сини гранули, следователно багрилото би трябвало да е преминало през мембраната като синята молекула. Експериментите показват друго. Синята форма почти не преминава. Преминава безцветната форма, а синьото, което виждате вътре, се образува там, след навлизането.

Това обръщане на представата е важно, защото определя какво може и какво не може да ни каже оцветяването. Сините гранули показват окислено багрило, което е било реоксидирано и задържано в органели. Те не показват общото количество багрило в клетката, не показват редуцирания пул и не измерват биологичния ефект. За да разберете защо, проследете трите стъпки: редукция на повърхността, дифузия на редуцираната форма, реоксидация и задържане вътре.

Двете форми се държат като различни молекули

Окисленото метиленово синьо е плоска, положително заредена пръстенна система. То се разтваря във вода, поглъща силно светлина около 600 до 700 нанометра и изглежда синьо. Ключът е в заряда. Заредена, хидрофилна молекула не преминава лесно през липидна мембрана, затова прецизната формулировка в литературата е „относително непроницаема за мембраната“, а не „непроницаема“.

Редуцираното метиленово синьо, наречено левкометиленово синьо, е безцветно, незаредено и мастноразтворимо. Отстранете заряда и мембраната престава да бъде стена. Редуцираната молекула преминава лесно чрез дифузия, а щом попадне в по-окислително вътреклетъчно отделение, може отново да загуби електрони и да се върне към синята, заредена форма, която остава задържана вътре. Следователно окислително-редукционната химия на багрилото е и неговият транспортен механизъм. Променете броя на електроните и ще промените пропускливостта.

Електроните за първата стъпка идват от самата клетка. Клетките на бозайниците осъществяват електронен транспорт през плазмената мембрана, като пренасят редукционни еквиваленти от вътреклетъчни донори навън към акцептори на повърхността. Тази трансплазмембранна активност е нормална клетъчна функция, срещана при повечето клетъчни типове, а повърхностната редуктаза на ендотелните клетки, която обработва тиазинови багрила, се държи като други редуктази в едно показателно отношение: тя продължава да работи в присъствието на цианид и азид в дози, които блокират последващите стъпки. Това разграничение е ключът към цялото обяснение.

Разпределението между фазите е първото обяснение и почти обяснява поемането

През 1929 г. Мариан Ъруин от Института „Рокфелер“ задава по-прост въпрос. Може би навлизането на багрилото е просто разпределение между водата и липидните слоеве на клетката, а в лабораторията слой хлороформ може да замести тези липидни слоеве. В своите спектрофотометрични изследвания на проникването тя разклаща водни разтвори на багрила с хлороформ и сравнява какво преминава в органичната фаза с това, което навлиза в живи клетки на водорасли.

Две открития от тази работа все още заслужават внимание. Първо, търговските разтвори на метиленово синьо съдържат триметилтионин, днес наричан Azure B, и този примес прониква по-бързо от самото метиленово синьо, особено при алкално pH, когато преобладава липидоразтворимата форма на свободна база. Част от привидното навлизане на метиленово синьо всъщност е селективно навлизане на Azure B. Второ, pH определя резултата чрез степента на йонизация, а увредените клетки допускат много повече багрило от неповредените. Коефициентите на разпределение и зарядовото състояние определят какво поглъщат както изкуствената система, така и живата клетка, а приликата между двете подкрепя идеята за неводни слоеве в клетъчната граница.

Моделът изпреварва времето си по отношение на липидите и йонизацията, но не може да разграничи багрило, което се разпределя между фазите в непроменен вид, от багрило, което се преобразува химически на повърхността, преминава в друга форма и се преобразува обратно вътре. За това разграничение е необходим различен експеримент, който идва седемдесет години по-късно с белодробния ендотел.

Редукция отвън, задържане вътре

Меркер и колегите му работят с култивирани ендотелни клетки от белодробната артерия на говеда и предлагат последователност от три стъпки: окисленото багрило се редуцира на клетъчната повърхност до безцветната си липофилна форма, редуцираната форма навлиза чрез дифузия, а вътреклетъчната реоксидация възстановява окислената форма, която не преминава през мембраната и се натрупва. След това тяхното изследване на поемането на тиазинови багрила от ендотелни клетки проверява тази последователност чрез опити да я прекъсне на определени места.

Първото средство е ферицианидът — акцептор на електрони, който не може да навлезе в клетката. Когато повърхностните ензими редуцират синьото багрило до безцветната му форма извън клетката, ферицианидът може да отнеме обратно тези електрони и да възстанови синьото багрило в средата, преди то изобщо да премине през мембраната. Докато ферицианидът присъства в излишък (10 микромоларно багрило спрямо 50 до 500 микромоларен ферицианид), поемането на багрилото почти спира и се възобновява с нормалната си скорост едва след изчерпването на ферицианида. Кинетиката потвърждава същото обяснение и по втори начин. Ферицианидът изчезва с приблизително постоянна скорост, в съответствие с постоянен поток на повърхностна редукция, захранващ многократно използваем медиатор, докато извънклетъчното багрило изчезва експоненциално с изчерпването на неговия пул. Постоянният поток, съчетан с изчерпващ се пул, означава, че сигналът от ферицианида отразява непрекъсната редукция, а не напускане на разтвора от молекули на багрилото.

Второто средство изцяло премахва стъпката на преминаване. Екипът свързва толуидиново синьо O, близко сродно тиазиново багрило, с голяма полиакриламидна верига, която е твърде голяма, за да навлезе в клетката при което и да е окислително състояние. Клетките въпреки това редуцират свързаното багрило. Следователно редукцията не изисква вътреклетъчен достъп. Механизмът е изложен на повърхността или е електрически свързан с нея.

След това идва разграничението, което дава заглавието на публикацията. Цианидът и азидът при 2 милимоларна концентрация силно потискат натрупването на багрилото, а под микроскоп тъмносините и виолетовите включвания, които обикновено обграждат ядрото, почти изчезват. Нито един от двата инхибитора обаче не забавя извънклетъчната редукция: цикличното преобразуване на ферицианида продължава без отслабване, а непроникващият полимер все така се редуцира. Блокирането е на последващ етап. Цианидът и азидът спират вътреклетъчната реоксидация и секвестрация, а не повърхностната редукция. Контролните проверки на жизнеспособността подкрепят това тълкуване, тъй като клетките запазват своя цитозолен маркерен ензим лактатдехидрогеназа при тези обработки, така че загубата на поемане не се дължи просто на токсично увреждане или разкъсване на мембраната.

Една уговорка от публикацията остава валидна. Сините включвания са разположени около ядрото, но не в него, което е съвместимо с окисление във вътреклетъчни органели, но изследването не установява кои органели са това. Подобни картини при други клетъчни типове са били определяни като лизозомни въз основа на оскъдни доказателства. Приемайте задържането за установено, а точното му местоположение — за предварително предположение. Читателите, които проследяват накъде отиват електроните след това, могат да продължат с митохондриалния електронен транспорт и окислително-редукционните процеси и с по-широката картина на абсорбцията и разпределението според пътя на въвеждане.

Оцветяването не е експозиция

Трето изследване показва какво се случва, когато тази логика на поемане се съпостави с биологичен показател. Скот и колегите му установяват, че метил-бета-циклодекстринът, захарна молекула с тороидална пръстеновидна форма, се свързва директно с метиленовото синьо, с асоциационна константа около 310 на молар за комплекса на включване спрямо около 5846 на молар за димеризацията на багрилото. Във фибробласти L929 това свързване блокира както клетъчното оцветяване, така и стимулирането на поемането на глюкоза: предварителната инкубация с циклодекстрина предотвратява синьото оцветяване, а добавянето му след това ускорява обезцветяването. Докато оптичният син сигнал изчезва от клетките, активираният транспорт на глюкоза отслабва в тясна успоредност с него.

Авторите тълкуват тази корелация като подкрепа за пряко взаимодействие между багрилото и белтък в пътя на активиране на глюкозния транспортер, а не за продължителен механизъм на оксидативен стрес. Този извод е разумен, но има ограничения. Експериментът не идентифицира белтъка, не показва свързване със самия транспортер, а корелацията между обезцветяването и загубата на ефект не може да изключи всички окислително-редукционно опосредствани пътища.

Трайният извод е свързан с измерването. Оптичното оцветяване показва видимото, окислено багрило, свързано с клетките. То изцяло пропуска безцветния редуциран пул, така че бледа клетка все още може да съдържа еквиваленти на багрилото, а интензивно оцветената клетка показва задържано окислено багрило, а не обща тъканна експозиция или величина на ефекта. Същата уговорка важи и в по-голям мащаб: сравняването на оцветяването между клетъчни типове или приемането на тъмен тъканен срез като доказателство за по-висока експозиция повтаря първоначалната грешка при наблюдението на клетките в съда. Поемането е цикъл от редукция, дифузия и реоксидация и всяка единична моментна снимка на синята форма показва само една част от него. Практическите последици за лабораторното оцветяване и работата с багрилото и за тълкуването на твърденията за доза и експозиция следват пряко от това.