FTIR і ІЧ-спектры метыленавага сіняга: даведнік па лабараторнай ідэнтыфікацыі

Уявіце, што тры лабараторыі атрымалі адзін і той жа сіні парашок. Першая рэгіструе інфрачырвоны спектр і вызначае, што гэта метыленавы сіні. Другая праводзіць храматаграфію і паведамляе пра 0.4% Azure B. Трэцяя даследуе дыфракцыю рэнтгенаўскіх прамянёў на крышталях і вызначае гідратную форму. Усе тры маюць рацыю, але ніводная не адказала на два астатнія пытанні. Блытаніна пачынаецца, калі адзін вынік успрымаюць як адказ на ўсе тры.

Гэты артыкул размяжоўвае гэтыя пытанні. Інфрачырвоная ідэнтыфікацыя пацвярджае малекулярную ідэнтычнасць праз параўнанне са стандартным узорам. Храматаграфія вызначае склад. Дыфракцыя вызначае форму ў цвёрдым стане. Станоўчы вынік праверкі ідэнтычнасці — не сертыфікат чысціні.

Інфрачырвоная ідэнтыфікацыя добра адказвае на адно пытанне

Фармакапейнае выпрабаванне на ідэнтычнасць метыленавага сіняга — гэта параўнанне спектра са стандартным узорам, а не праверка па спісе пікаў. У папярэднім праглядзе манаграфіі USP на метыленавы сіні раздзел «Ідэнтыфікацыя A» прадугледжвае інфрачырвоную спектраскапію з выкарыстаннем або оптыкі ATR, або таблеткі з браміду калію. Спектр узору павінен адпавядаць спектру стандартнага ўзору USP, прычым абодва ўзоры трэба падрыхтаваць і зарэгістраваць у эквівалентных умовах. Ніякі фіксаваны спіс дыягнастычных хвалевых лікаў не вызначае вынік. Яго вызначае накладанне спектраў.

Такі падыход адлюстроўвае асаблівасці FTIR-спектраў метыленавага сіняга. Найбольш інтэнсіўныя палосы знаходзяцца ў вобласці адбіткаў пальцаў. У літаратуры асноўную паласу спалучанай кальцавой сістэмы паслядоўна адносяць да вобласці каля 1590–1600 cm-1, дзе ўзаемадзейнічаюць валентныя ваганні араматычных сувязяў вуглярод–вуглярод і вуглярод–азот. Іншыя палосы каля 1490 і 1390 cm-1 звязаны з дэфармацыйнымі ваганнямі кольцаў, сувязяў вуглярод–азот і вуглярод–вадарод. Палосы каля 1355 і 1330 cm-1 звязаны з сувязямі вуглярод–азот у д dimетыламінагрупах і дэфармацыйнымі ваганнямі метыльных груп. Палосы каля 1225–1250 cm-1 належаць гетэрацыклічнаму каркасу, а палосы каля 1170–1130 і 1066 cm-1 звязаны з ваганнямі сувязяў вуглярод–сера; дэфармацыйныя ваганні араматычных C-H назіраюцца каля 880 cm-1. Валентныя ваганні знаходзяцца пры вышэйшых хвалевых ліках: араматычныя C-H — каля 3040 cm-1, а C-H у N-метыльных групах — прыкладна паміж 2900 і 3000 cm-1. Апублікаваныя аднясенні палос адрозніваюцца ў дэталях, бо фенатыязініевы каркас вагаецца як звязаная сістэма, таму любую асобную табліцу аднясенняў варта ўспрымаць як адзін з апісаных варыянтаў, а не як адзіны магчымы.

Два эфекты падрыхтоўкі заслугоўваюць увагі, бо яны змяняюць ІЧ-спектры метыленавага сіняга, не змяняючы сам фарбавальнік. Па-першае, гідратаваны матэрыял дае шырокую паласу O-H каля 3300–3500 cm-1 і паласу дэфармацыйных ваганняў вады каля 1630–1640 cm-1, а розныя гідратныя формы выклікаюць вымерныя зрухі палос у вобласці адбіткаў пальцаў. Па-другое, матрыца таблеткі KBr гіграскапічная: паглынутая вільгаць утварае палосы менавіта ў гэтых абласцях вады і можа быць памылкова прынятая за гідратную ваду з узору. Вымярэнне метадам ATR дазваляе абысціся без матрыцы KBr, але інтэнсіўнасці ў ATR залежаць ад глыбіні пранікнення, якая змяняецца з хвалевым лікам, таму ATR-спектр і спектр прапускання аднаго і таго ж парашку нельга непасрэдна накласці адзін на адзін. З фармакапейнага патрабавання вынікае практычнае правіла: параўноўвайце спектры ўзору і стандартнага ўзору, зарэгістраваныя адным і тым жа метадам, і дакументуйце выкарыстаны метад. Пра хімію катыёна, солі і гідратаў, якая ляжыць у аснове гэтых спектраў, чытайце ў даведніку па структуры і ўласцівасцях метыленавага сіняга.

Табліца выбару аналітычнага метаду

Гэтая табліца дапамагае выбраць метад. Чытайце радок злева направа, каб даведацца, на якое пытанне адказвае метад, што пацвярджае станоўчы вынік і што застаецца недаказаным.

Метад	На якое пытанне адказвае	Што пацвярджае станоўчы вынік	Чаго не можа пацвердзіць
FTIR у параўнанні са стандартным узорам	Ці з'яўляецца гэты матэрыял метыленавым сінім?	Малекулярную ідэнтычнасць, узгодненую з эталонным спектрам	Чысціню, профіль прымесей, гідратную форму сам па сабе або канцэнтрацыю
Колькаснае вызначэнне і аналіз арганічных прымесей метадам HPLC-UV (фенільная калонка, 246 nm)	Колькі метыленавага сіняга і колькі Azure B?	Храматаграфічную ідэнтычнасць паводле супадзення ўтрымлівання; колькаснае ўтрыманне і колькасці зададзеных прымесей	Форму ў цвёрдым стане; ідэнтычнасць нечаканых пікаў без стандартных узораў
LC-MS/MS з кваліфікаванымі стандартнымі ўзорамі	Якія дэметыляваныя фарбавальнікі прысутнічаюць?	Раздзяленне і ідэнтыфікацыю ў шэрагу MB, Azure A, Azure B, Azure C, тыянін	Фармакапейны статус; гэта пашырэнне для даследаванняў, а не звычайнае выпрабаванне паводле манаграфіі
Парашковая XRD	Які крышталічны гідрат прысутнічае?	Фазу ў цвёрдым стане, фазавыя сумесі вышэй за мяжу выяўлення і крышталічнасць	Малекулярную ідэнтычнасць аморфных прымесей; канцэнтрацыю раствору
Паглынанне UV-Vis	Ці паглынае раствор святло чаканым чынам?	Характэрныя максімумы паглынання і паводзіны, залежныя ад канцэнтрацыі	Ідэнтычнасць або чысціню само па сабе
Ідэнтыфікацыя хларыду і страта масы пры высушванні (дапаможныя)	Ці прысутнічае супрацьіён; якая частка масы з'яўляецца лятучай?	Солевую форму і страту масы пры высушванні ў зададзеных умовах	Якая малекула абумоўлівае колер

Чаму супадзенне інфрачырвоных спектраў — не сертыфікат чысціні

Супадзенне пры праверцы ідэнтычнасці выключае няправільны фарбавальнік. Але яно не дае поўнага пераліку кампанентаў узору. Найбольш важныя тры абмежаванні.

Па-першае, блізкія злучэнні падобныя ў інфрачырвоным дыяпазоне. Azure B адрозніваецца ад метыленавага сіняга толькі адной метыльнай групай, таму яго спектр вельмі падобны да спектра метыленавага сіняга. Спектр сумесі, якая змяшчае некалькі працэнтаў Azure B, усё яшчэ добра накладаецца на спектр стандартнага ўзору метыленавага сіняга. Выяўленне гэтай прымесі — задача храматаграфіі, разгледжаная ў даведніку па прымесях метыленавага сіняга і метадах выпрабаванняў.

Па-другое, інфрачырвоная спектраскапія даследуе ўзор у цэлым і мае абмежаваную адчувальнасць да мінорных кампанентаў. Невялікія колькасці роднасных фарбавальнікаў, рэшткавых растваральнікаў або неарганічных рэшткаў хаваюцца пад асноўнымі палосамі. Адсутнасць дадатковых пікаў — слабы доказ адсутнасці прымесей.

Па-трэцяе, стандартны ўзор вызначае ўсё параўнанне. Стандартны ўзор, які дэградаваў, мае спектральныя зрухі праз гідратацыю або з якім няправільна абыходзіліся, змяняе аснову ацэнкі. Тое самае адбываецца пры спалучэнні несумяшчальных метадаў, напрыклад калі ATR-спектр узору ацэньваюць паводле спектра стандартнага ўзору ў KBr. Разам з кожным заключэннем запісвайце нумар партыі стандартнага ўзору, метад і спосаб падрыхтоўкі.

Сумесі патрабуюць яшчэ адной засцярогі. Спектр, які пераважна супадае, але мае плечы палос або анамаліі інтэнсіўнасці, — гэта не станоўчы вынік з заўвагамі. Гэта сігнал, што перад ідэнтыфікацыяй кампаненты ўзору трэба раздзяліць.

Дадатковыя метады на практыцы

HPLC метыленавага сіняга дае адказ пра склад, якога не можа даць інфрачырвоная спектраскапія. Чынны фармакапейны метад выкарыстоўвае калонку фенільнага тыпу з градыентам вада–ацэтанітрыл, які змяшчае трыфторвоцатную кіслату, і дэтэктаванне пры 246 nm, а не ў бачнай вобласці. Ідэнтычнасць вызначаецца паводле адпаведнасці часу ўтрымлівання стандартнаму ўзору; тое самае параўнанне служыць для колькаснага вызначэння. Выпрабаванне на арганічныя прымесі ідэнтыфікуе Azure B з дапамогай асобнага стандартнага ўзору пры адносным утрымліванні каля 0.8 у параўнанні з 1.0 для метыленавага сіняга і патрабуе высокага раздзялення паміж двума пікамі. Звярніце ўвагу на выбар даўжыні хвалі: у шэрагу дэметыляваных злучэнняў паглынанне паступова зрушваецца ў чырвоную вобласць — ад тыяніну каля 600 nm праз Azure C, Azure A і Azure B да метыленавага сіняга каля 670 nm. Таму дэтэктар, наладжаны прыкладна на 660 nm, дае неаднолькавы водгук для розных прадстаўнікоў шэрагу і заніжае ўтрыманне некаторых гамолагаў. Поўнае прафіляванне ўсяго шэрагу, калі яно патрэбнае, варта праводзіць метадам LC-MS/MS на калонцы C18 з кваліфікаванымі стандартнымі ўзорамі для кожнага аналіту.

Парашковая дыфракцыя адказвае на пытанне пра цвёрды стан, інфармацыю пра які абодва вышэйзгаданыя метады знішчаюць або ігнаруюць: растварэнне парашку для храматаграфіі сцірае інфармацыю пра крышталі, а малекулярныя ваганні характарызуюць сувязі, а не далёкі парадак упакоўкі. Дыфракцыйныя карціны дазваляюць адрозніваць гідратныя фазы і ацэньваць крышталічнасць, і метыленавы сіні патрабуе такой увагі больш, чым большасць матэрыялаў. Даследаванні цвёрдага стану Рагера і яго калег выявілі пяць розных гідратных структур, у тым ліку пентагідрат, два дыгідраты, монагідрат і прамежкавы гідрат, і не выявілі сапраўднага трыгідрату сярод ахарактарызаваных форм. Абыходжанне з матэрыялам у лабараторыі тут мае значэнне: вільготнасць і тэмпература змяняюць стабільнасць гідратаў, а інтэнсіўнае драбненне можа змяніць фазу або знізіць крышталічнасць, таму кантралюйце і дакументуйце адносную вільготнасць і тэмпературу, а драбненне зводзьце да мінімуму. Маркіроўка гідратаў і яе ўплыў на ўзважаную масу падрабязней разгледжаны ў артыкуле пра гідратныя формы метыленавага сіняга і іх маркіроўку.

Паглынанне UV-Vis адыгрывае дапаможную ролю. Вядомыя максімумы пацвярджаюць чаканыя паводзіны раствору і дазваляюць вызначаць канцэнтрацыю, але сіні раствор, які паглынае святло на чаканай даўжыні хвалі, толькі ўзгадняецца з прысутнасцю метыленавага сіняга, не даказваючы яе, бо роднасныя фарбавальнікі паглынаюць святло паблізу.

Што спытаць перад купляй

Ператварыце гэтыя адрозненні ў пытанні пры закупцы. Спытайце, якую партыю правяралі, якім метадам пацвердзілі ідэнтычнасць, ці выкарыстоўваўся стандартны ўзор Azure B пры HPLC-выпрабаванні на прымесі і ці была гідратная форма ахарактарызаваная або толькі меркаваная. Найперш спытайце, ці ахоплівае сертыфікат усю спецыфікацыю або толькі асобныя выпрабаванні. Многія прадаўцы, якія заяўляюць пра адпаведнасць фармакапеі, правяраюць толькі цяжкія металы, пакідаючы без адказу пытанні ідэнтычнасці, колькаснага ўтрымання, арганічных прымесей, растваральнікаў і мікрабіялагічных паказчыкаў.

Blupreme праводзіць выпрабаванні паводле поўнай спецыфікацыі USP, якія ахопліваюць ідэнтычнасць, чысціню, арганічныя прымесі, рэшткавыя растваральнікі, элементныя прымесі, рэшту пасля пракальвання, мікрабіялагічныя межы і бактэрыяльныя эндатаксіны, у партнёрстве з фармацэўтычным вытворцам метыленавага сіняга. Агульнадаступны сертыфікат аналізу кожнай партыі публікуецца на старонцы кантролю якасці Blupreme, таму аснову разліку колькаснага ўтрымання і вынікі аналізу прымесей можна прачытаць непасрэдна, а не выводзіць з ускосных звестак. Для вынікаў каля 100% усё роўна трэба пазначаць аснову разліку, як тлумачыцца ў даведніку па выніках колькаснага вызначэння вышэй за 100 працэнтаў. Супадзенне пры праверцы ідэнтычнасці адкрывае даследаванне. Поўная дакументацыя яго завяршае.