Metilen mavisini hüceyrə tənəffüsü ilə əlaqələndirən təcrübələr

Fibrindən təmizlənmiş insan qanı üç saat ərzində 37 °C temperaturda saxlandıqda tərkibindəki oksigenin təxminən iki faizini sərf edir. İnkubasiyadan əvvəl az miqdarda metilen mavisi əlavə etdikdə isə eyni qan oksigenin təxminən altmış beş faizini sərf edir. Hüceyrələrdə heç nə dəyişməmişdi. Yalnız məhlul dəyişmişdi.

Bu rəqəm Johns Hopkins-də George Harrop və E. S. Guzman Barron tərəfindən 1928-ci ildə dərc edilmiş məqalədən götürülüb və metilen mavisinin hüceyrə tənəffüsünü yaxşılaşdırdığı barədə geniş təkrarlanan fikrin başlanğıcıdır. Bu fikir yanlış deyil, amma mənası səsləndiyindən daha məhduddur.

Cədvəldəki rəqəm əslində nəyi ölçür

Ölçülən son göstərici qaz analizi ilə müəyyənləşdirilən oksigen udulması idi. Harrop və Barron leykositləri ayırmaq üçün təzə götürülmüş qanı 10 °C temperaturda pambıqdan keçirdilər, nümunəni oksigenlə doydurdular, iki hissəyə böldülər, bir hissəyə boya əlavə etdilər və inkubasiyadan sonra hər ikisini təhlil etdilər. Leykosit sayı nadir hallarda kub millimetrdə təxminən mini keçirdi. Oksigen sərfi nümunənin ilkin oksigen miqdarının yox olmuş hissəsi kimi ifadə edilirdi.

Onlar karbon dioksidi də ölçürdülər, lakin burada metod çətinlik yaratdı. Fibrindən təmizlənmiş qan inkubasiyanın ilk saatında tədqiq edilən reaksiya ilə əlaqəsi olmayan səbəblərdən hər 100 mL üçün iki millimola qədər karbon dioksid buraxırdı. Buna görə tam qandan hesablanan tənəffüs əmsalları yararsız idi. Yalnız Locke məhlulundakı yuyulmuş hüceyrələr şərh oluna bilən nəticələr verdi və həm boya ilə, həm də boyasız alınan göstəricilər 0.73 ilə 0.80 arasında cəmləndi.

Bu detal əhəmiyyətsiz deyil. Həmin məqalələrdə “tənəffüs” qapalı qab daxilində qaz mübadiləsi deməkdir. Oksigen sərfi ilə faydalı enerji hasilatı arasındakı fərq oksigen sərfinin ATP haqqında nəyi göstərdiyi və nəyi göstərmədiyi məqaləsində ayrıca araşdırılır.

Boya ən az tənəffüs edən hüceyrələrdə ən çox artım yaratdı

Yetkin məməli eritrositlərinin ölçülə bilən oksigen sərfi demək olar ki, yoxdur. Quşların nüvəli eritrositlərində isə var. Harrop və Barron hər ikisini sınaqdan keçirdilər və bu fərq onların arqumentinin əsasını təşkil edir.

Məməli nümunələrində boya iyirmi ilə əlli dəfə arasında artım yaratdı. Hüceyrələri onsuz da tənəffüs edən qaz qanında isə sürəti heç vaxt iki dəfədən çox artırmadı. Başlanğıc tənəffüs nə qədər yüksək idisə, boyanın əlavə təsiri bir o qədər az idi.

Eyni qanunauyğunluq bir növ daxilində də görünür. Həqiqi polisitemiyalı xəstədən götürülmüş, yetişməmiş hüceyrələr olan insan qanı nümunəsi boyasız oksigeninin 11.3 faizini sərf edirdi; sağlam donordan götürülmüş yuyulmuş hüceyrələrdə bu göstərici 2.8 faiz idi. Boya onu yalnız 63.4 faizə çatdırdı: normal hüceyrələrdə təxminən otuzqat sürətlənmə olduğu halda, burada altıqat sürətlənmə baş verdi. Boya yetkin hüceyrələrin davranışını yetişməmiş hüceyrələrin davranışına yaxınlaşdırırdı və müəlliflər də onun məhz bunu etdiyini bildirirdilər.

Sianid bunu dayandırmalı idi

Sianidin hüceyrə oksidləşməsini dayandırdığı məlum idi. Buna baxmayaraq, Harrop və Barron onu boya ilə birlikdə əlavə etdilər.

İribuynuzlu mal-qaranın qanı ilə alınmış nəticələr ümumi mənzərəni əks etdirir. Heç nə əlavə edilmədikdə üç saat ərzində oksigen miqdarı həcm faizi ilə 22.61-dən 22.03-ə düşdü. Metilen mavisi ilə 12.84-ə endi. Metilen mavisi və molyarın beş mində biri qatılığında kalium sianidlə isə 12.74-ə düşdü. Boyanın təsiri, demək olar ki, dəyişmədi.

Şəkil: insan eritrositlərinin fasiləsiz mikrotənəffüs qeydi. Ox metilen mavisinin əlavə edildiyi anı göstərir. Bundan əvvəl xətt demək olar ki, üfüqidir; sonra ardıcıl yüksəlir. Harrop və Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478 məqaləsindən götürülüb.

Onların qənaətinə görə, boya oksigen daşıyıcısı kimi fəaliyyət göstərərək “yetkin məməlilərin nüvəsiz eritrositlərindən yox olmuş bir maddəni təmin edirdi”. İki il sonra Rockefeller İnstitutunda Michaelis və Salomon fikir ayrılığını bu gün də qüvvədə olan şəkildə ifadə etdilər. Ya boyanın təsiri “boyanın təsadüfi bir xüsusiyyəti” idi, ya da boya “orqanizmlərdəki hansısa naməlum maddənin modeli” idi. Bu iki ehtimal arasındakı məsələ hələ həll olunmayıb. Dəyişən odur ki, indi hüceyrələri daha dəqiq təsvir etmək mümkündür.

Qaraciyər ekstraktı da eyni təsiri göstərdi

Michaelis və Salomon orqanların soyuq su ekstraktlarının eyni stimullaşdırıcı təsiri yaratdığını göstərdilər. Ən güclü təsir siçovul qaraciyərində idi; onu böyrək, dalaq və xaya izləyirdi. Beyin, əzələ və qan zərdabı isə ya az təsir göstərirdi, ya da heç təsir göstərmirdi.

Sonra onlar ekstraktı karbon monoksidin iştirakı ilə sınaqdan keçirdilər. İstər ekstraktın, istərsə də boyanın yaratdığı tənəffüs 98 faiz karbon monoksid və 2 faiz oksigen qarışığında dəyişmirdi. Eyni qaz qarışığı maya hüceyrələrinin və quşların nüvəli eritrositlərinin tənəffüsünü təxminən 60–80 faiz azaldırdı. Bu, Warburgun karbon monoksidə həssas tənəffüs fermenti haqqında izahına uyğun idi. Buna görə də müəyyənləşdirilməmiş toxuma maddəsi Warburgun fermenti deyildi.

Araşdırma zamanı həmin maddənin kimliyi ilə bağlı bir neçə ehtimal rədd edildi. Reduksiya olunmuş qlutation və sistein yalnız öz oksidləşmələri üçün tələb olunan oksigen sərfini yaradırdı. Harden və Youngun kofermenti ehtimalı kənarlaşdırıldı, çünki ən çox əzələdə olurdu, halbuki əzələ ən zəif təsirlərdən birini göstərmişdi. Bir neçə il əvvəl adlandırılmış Keilin sitoxromu da eyni ziddiyyətlə üzləşdi. Aktiv maddənin hüceyrə nüvəsindən gəldiyi barədə öz fikirlərini isə sadəcə bir ehtimal adlandırdılar.

Təsirin baş verməsi üçün müəyyən şərtlər lazım idi

Hüceyrələr bütöv olmalı idi. Distillə edilmiş su və ya təkrar dondurma ilə törədilən hemoliz həm boyaya, həm də ekstrakta cavabı aradan qaldırırdı; qismən hemoliz isə cavabı mütənasib şəkildə azaldırdı.

Şəkər də tələb olunurdu. Qlükoza, fruktoza və saxaroza boyanın yaratdığı tənəffüsü təmin edirdi; mannitol isə etmirdi. Şəkər olmadıqda tənəffüs ümumiyyətlə baş vermirdi və boya bu prosesdə hüceyrələri zədələyirmiş kimi görünürdü. Buna görə bir və ya iki saat sonra əlavə edilən qlükoza tənəffüsü bərpa etmirdi. Müəlliflər boyanın hüceyrəyə lazım olan struktur komponentini oksidləşdirdiyini ehtimal etdilər.

İşıqlandırma boyanın təsirini xeyli artırırdı, baxmayaraq ki, təsir qaranlıqda da aydın görünürdü. Digər reduksiya oluna bilən boyalar fərqli davranırdı: toluilen mavisi metilen mavisi qədər və ya ondan daha güclü təsir göstərirdi, indiqo disulfonat isə demək olar ki, heç nə etmirdi. Boyanın oksidləşmə-reduksiya potensialı ilə təsirinin böyüklüyü arasında aydın əlaqə aşkar olunmadı. Müəlliflər bunu membran keçiriciliyi və toksikliklə izah edirdilər.

Təsir tənəffüslə deyil, qıcqırma ilə əlaqəli idi

Barronun 1930-cu il tədqiqatı hüceyrə suspenziyalarından normal siçovul orqanlarının və köçürülmüş şişlərin toxuma kəsiklərinə keçdi.

Aerob qlikoliz olmayan toxumalarda metilen mavisi ya heç bir təsir göstərmirdi, ya da oksigen sərfini bir qədər azaldırdı: böyrəkdə təxminən 14 faiz, mədəaltı vəzidə təxminən 14 faiz, qaraciyərdə təxminən 5 faiz. Oksigenin iştirakı ilə qıcqırma gedən toxumalarda isə sərfi artırırdı: dalaqda təxminən 8 faiz, beyində təxminən 13 faiz. Şişlərdə artım insan süd vəzi karsinomasında təxminən 27 faizdən Rous toyuq sarkomasında 80 faizdən çox göstəriciyə qədər dəyişirdi və hər toxumanın aerob qlikolizi ilə təxminən mütənasib idi.

Şəkil: hər nöqtə bir toxuma növünü göstərir. Üfüqi ox aerob qlikolizi, şaquli ox isə metilen mavisi əlavə edildikdən sonra oksigen sərfinin dəyişməsini göstərir. Məlumatlar Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Cədvəl 6, PMID 19869777 məqaləsindən götürülüb.

Sianid təcrübəsi isə bunun əks mənzərəsini yaratdı. Əvvəllər cavab verməyən həmin toxumalarda tənəffüs sianidlə bloklandıqda və qıcqırma ön plana çıxdıqda boya oksigen sərfini yenidən artırdı: böyrəkdə təxminən 59 faiz, qaraciyərdə təxminən 19 faiz, dalaqda təxminən 286 faiz, xayada təxminən 200 faiz.

Barron boyanın hüceyrənin və ya toxumanın qıcqırma qabiliyyətini yoxlamaq üçün istifadə oluna biləcəyini irəli sürdü və məqaləsini bir fərziyyə ilə bitirdi: boya olan mühitdə şiş kulturasının nəsillər boyu yetişdirilməsi bir gün şiş metabolizmini daimi olaraq normal toxumanın metabolizminə bənzədə bilər. Bu, 1930-cu ildə yazılmış tədqiqat sualı idi. Müalicə iddiası deyil.

Təcrübələr nəyi ölçmüş ola bilməzdi

1928 və 1930-cu illərdə “tənəffüs” oksigen sərfi demək idi. Adenozin trifosfat haqqında ilk məlumat 1929-cu ildə verildi; təcrid olunmuş mitoxondrilərin elektronları ötürərkən fosfatı esterləşdirdiyinin nümayişi isə 1949-cu ilə təsadüf edir. Metilen mavisi haqqında erkən məqalələrin heç biri enerji istehsalını ölçmüş ola bilməzdi və heç biri bunu etdiyini iddia etmirdi.

İkinci problem hüceyrələrdir. Yetkin məməli eritrositlərində mitoxondri yoxdur. Retikulosit mərhələsində onlar seçici autofagiya ilə mitoxondriləri və ribosomları kənarlaşdırırlar. Buna görə yetkin eritrosit qlikoliz hesabına fəaliyyət göstərir və pentoz-fosfat yolundan əsasən ATP üçün deyil, NADPH üçün asılıdır. 1928-ci il təcrübələrində bərpa ediləsi elektron daşıma zənciri yox idi. Oksigeni sərf edən proses başqa bir iş görürdü.

Bu başqa prosesin nə olduğu indi kifayət qədər yaxşı təsvir olunub. Metilen mavisi hüceyrənin reduksiyaedici ekvivalentlərindən elektron qəbul edərək leykometilen mavisinə çevrilir; o isə molekulyar oksigenlə yenidən oksidləşir və dövr tamamlanır. İnsan eritrositlərində reduksiya mərhələsini NADPH-dan asılı flavin reduktaza və əlaqəli disulfid reduktazalar həyata keçirir. Nişanlanmış qlükozadan istifadə edən 1976-cı il tədqiqatı boyanın heksoza-monofosfat şuntunu stimullaşdırdığını, aşağı qatılıqdakı təsirin oksihemoqlobindən asılı olduğunu və daha yüksək qatılığın — 0.1 mM — hidrogen peroksid yaratdığını aşkar etdi. Reduksiya olunmuş boya oksigenlə qarşılaşanda fosfat rabitələri deyil, peroksid əmələ gətirir.

Mitoxondrilərdəki mənzərə geniş yayılmış xülasələrin qəbul etdiyindən daha mübahisəlidir. Bir tədqiqat istiqamətinə görə, boya elektronları I kompleksin bölgəsindən götürüb sitoxrom c-yə ötürür. Başqa bir tədqiqat siçan beyninin mitoxondrilərində onun antimisin blokadasından sonra tənəffüsü bərpa edə bilmədiyini aşkar etdi və elektron qəbuledicisini III kompleksin ubixinol-bağlayan sahəsində yerləşdirdi. Üçüncü tədqiqat aşağı qatılıqların ADP ilə stimullaşdırılan tənəffüsü dəyişmədən saxlayaraq bazal oksigen sərfini artırdığını aşkar etdi. Məsələnin ən birbaşa ifadəsi budur: metilen mavisinin yaratdığı oksigen sərfi ümumiyyətlə oksidləşdirici fosforlaşmadan asılı deyil. Bu sərf tənəffüs zənciri inhibə edildikdə və belə zənciri olmayan preparatlarda da davam edirdi.

Bu iki kəmiyyət arasındakı fərqin birbaşa ölçmələri də mövcuddur. Təcrid olunmuş siçovul qaraciyəri mitoxondrilərində boyanın qatılığının artırılması tənəffüs nəzarəti əmsallarını azaldır və şişməyə səbəb olurdu. Müəlliflər bunu oksidləşdirici fosforlaşmanın ayrılması kimi təsvir edirdilər. Perfuziya olunan siçovul qaraciyərində metilen mavisi oksigen sərfini artırarkən ATP-nin ADP-yə nisbəti azalırdı.

Klinik məlumatlar da eyni məqamı göstərir. Methemoqlobinemiya NADPH-dan asılı reduksiya yolu vasitəsilə, venadaxili olaraq hər kiloqrama təxminən bir-iki milliqram metilen mavisi verilməklə müalicə olunur, daha böyük dozalar isə müalicə edilən vəziyyətin özünə səbəb olur. Eyni icmal qeyd edir ki, antidot təsiri bütöv eritrositlərdə ən güclüdür və hemoliz olduqda azalır. Bu, 1930-cu ildə hemolizlə bağlı alınmış nəticənin yetmiş üç il sonra xəstəxana kontekstində yenidən üzə çıxmasıdır. Faydalı və zərərli təsirləri doza həddinin əks tərəflərində yerləşən birləşmənin dozası oksigen sərfi ölçməsindən çıxarılmamalıdır.

Partiya niyə müzakirənin bir hissəsidir

Harrop və Barron yenidən oxumağa dəyər bir məqamı müşahidə etmişdilər. Metilen mavisinin özü spektroskopda methemoqlobinin iki xarakterik zolağı arasında bir zolaq yaradır və bu, “səthi baxış zamanı asanlıqla çaşqınlığa səbəb ola bilər”. Boya axtarılan maddəni təqlid edə bilər.

Eyni problemin kimyəvi forması da var. Kiçik tərkib hissəsi kimi mövcud olan əlaqəli fenotiazin özünəməxsus redoks davranışına, keçiriciliyə və toksikliyə malikdir. Sənədləşdirilmiş bir hal bunun əhəmiyyətini konkretləşdirir: metilen mavisinin yodlaşdırılmasına dair tədqiqatda tərkibində təxminən 7–8 faiz Azure B olan nümunələr əsasən yodlaşdırılmış Azure B əmələ gətirdi. Beləliklə, reaksiyada metilen mavisi deyil, qarışıq üstünlük təşkil etdi.

Laboratoriyada, boyama masasında və ya akvariumda metilen mavisini reagent kimi istifadə edən hər kəs, partiya xarakterizə edilməyibsə, tərkibi dəqiq müəyyənləşdirilməmiş materialla işləyir. Əlaqəli maddələr, identifikasiya, element qarışıqları, qalıq həlledicilər və yandırıldıqdan sonrakı qalıq təcrübənin ətrafındakı sənədləşmə deyil, onun bir hissəsidir. Blupreme metilen mavisini əczaçılıq istehsalçısından əldə edir və yalnız ağır metalları deyil, bütün USP spesifikasiyasını yoxlayan tam analiz sertifikatını dərc edir; analiz sertifikatını oxumaq üçün bələdçi və USP dərəcəsi təyinatının nəyi təsdiqlədiyi və nəyi təsdiqləmədiyi məqalələri sənədi iddia ilə tutuşdurmağın yollarını izah edir.

Rəqəm doğru idi

1928 və 1930-cu illərin təcrübələri diqqətlə aparılmışdı və onların əsas müşahidəsi qüvvədə qalır: reduksiya oluna bilən boya demək olar ki, tənəffüs etməyən hüceyrənin, sianidin blokladığı mərhələdən keçmədən, bazal sürətindən dəfələrlə çox oksigen sərf etməsinə səbəb ola bilər.

Səhv sonradan, “tənəffüs” sözünə müasir mənası verildikdə yaranır. Qaz mübadiləsi ölçməsi elektronların oksigenə çatdığını göstərir. Lakin həmin elektronlardan hər hansı birinin ATP yaratmaq üçün istifadə edildiyini göstərmir. Mitoxondrisi olmayan hüceyrədə isə bu iki ifadə arasındakı fərq mümkün qədər böyükdür. Metilen mavisinin hüceyrələrdə gördüyü işlərin daha geniş xəritəsi eyni fərqi daha geniş çərçivədə təqdim edir, birləşmənin boyadan dərmana keçid tarixi isə tekstil boyasının ilkin olaraq bu təcrübələrə necə gəlib çıxdığını izah edir.