هل يمكن للميثيلين الأزرق تجاوز المركب الثالث في الميتوكوندريا؟ لماذا تختلف الدراسات

سأل مختبران ما إذا كان بإمكان الميثيلين الأزرق تجاوز المركب الثالث المحجوب في الميتوكوندريا. أجاب أحدهما بلا. وأجاب الآخر بنعم. وكان لدى كليهما بيانات.

وجدت الدراسة الأولى، على ميتوكوندريا دماغ الفئران، أن الصبغة لا تستطيع ذلك. أما الثانية، على ميتوكوندريا الدماغ من ثلاثة أنواع من القوارض، فوجدت أنها تستطيع ذلك جزئيًا. وغالبًا ما تُذكر دراسة ثالثة، على كبد الفأر، بجانب الدراستين لكنها اختبرت شيئًا مختلفًا. ضعها في سياقها وستتلاشى نصف حالة الالتباس.

لا توجد آلية شاملة يمكن إعلانها. هناك ثلاث تجارب بمانعات مختلفة وجرعات مختلفة وقياسات مختلفة. اقرأ الظروف أولًا. ثم تأتي الاستنتاجات.

ما معنى التجاوز هنا

تدخل الإلكترونات إلى السلسلة عبر المركب الأول (من NADH) أو المركب الثاني (من السكسينات)، وتمر عبر المركب الثالث إلى السيتوكروم c، ثم عبر المركب الرابع إلى الأكسجين. والتدرج الناتج على طول هذا المسار هو ما تنفقه الخلية لصنع ATP.

يدعي مفهوم التجاوز أن الميثيلين الأزرق يلتقط الإلكترونات قبل موضع الانسداد ويسلمها بعده. تلتقط الصبغة المؤكسدة الإلكترونات من NADH أو مكونات السلسلة المبكرة، فتصبح ليوكوميثيلين أزرق، ثم يسلم الشكل المختزل الإلكترونات إلى السيتوكروم c أو يعيد إدخالها في السلسلة. إذا وقع التسليم بعد موضع الانسداد، فإن التنفس وجهد الغشاء يستعيدان جزءًا من نشاطهما. وإذا وقع عند موضع الانسداد أو قبله، فلا يحدث استرداد.

هناك تفصيل واحد في المركب الثالث يحسم جزءًا كبيرًا من هذا الخلاف. يعمل المركب وفق دورة Q التي تحتوي على موقعي تثبيط. يرتبط Antimycin بموقع Qi. ويرتبط Myxothiazol بموقع Qo. الدراسة التي تستخدم أحدهما فقط تختبر نصف المركب فقط.

الدراسة الأولى: لا يوجد تجاوز في ميتوكوندريا دماغ الفأر

استخدم Gureev وزملاؤه ميتوكوندريا القشرة الدماغية من فئران C57BL/6، معزولة بالديجيتونين، ومقاسة عند 0.1 mg من البروتين لكل ml. شملت الركائز ثلاث حالات: البيروفات مع المالات عند 5 mM لكل منهما، والسكسينات عند 10 mM مع الغلوتامات عند 2 mM، وL-proline عند 10 mM. كانت المانعات rotenone عند 1 micromolar (المركب الأول) وantimycin عند 1 microgram per ml (المركب الثالث). كانت جرعات الصبغة 0.5 و1 و2 micromolar، مع 1 micromolar كالتركيز الأساسي. توجد الطرق والمنحنيات في تقرير FEBS Letters.

نجح تجاوز المركب الأول. خفّض rotenone التنفس المحفز بـ ADP من نحو 121 إلى نحو 2 nmol per minute per mg، وأعاد 1 micromolar من الصبغة رفعه إلى نحو 21. واستعاد جهد الغشاء مع البيروفات والمالات ومع L-proline.

لكن تجاوز المركب الثالث لم ينجح. خفّض Antimycin التنفس إلى نحو 16، ورفعته الصبغة فقط إلى نحو 20. ولم يستعد جهد الغشاء مع أي ركيزة، حتى عند جرعات الصبغة التي وصلت إلى 5 micromolar. أشارت بيانات البيروكسيد إلى الاتجاه نفسه: رفعت الصبغة وحدها انبعاث البيروكسيد من معدل أساسي قريب من 76 pmol per minute per mg إلى نحو 1170 و1460 و1945 عند الجرعات الثلاث، ومع ذلك خفّض Antimycin الإشارة الناتجة عن الصبغة بنحو 25 و88 و96 بالمئة على التوالي. إذا كانت الصبغة المختزلة تتفاعل مباشرة مع الأكسجين، فلن يؤدي حجب المركب الثالث إلى خفض الإشارة. استنتج المؤلفون أن الصبغة المختزلة تتأكسد عند موقع Qo في المركب الثالث، قبل انسداد Antimycin. المسار المختصر بالكلمات: مانحون إلى الصبغة، الصبغة إلى Qo، ثم المسار الطبيعي بعد ذلك. يتم تجاوز rotenone. ولا يتم تجاوز Antimycin.

الدراسة الثانية: تجاوز جزئي في ثلاثة أنواع، عند موقعي التثبيط كليهما

وسّع Svab وزملاؤه التصميم التجريبي. استخدموا ميتوكوندريا دماغية من الفئران والجرذان وخنازير غينيا، معزولة بتدرج Percoll، ومقاسة عند نفس التركيز 0.1 mg per ml، باستخدام البيروفات والمالات أو الغلوتامات والمالات عند 5 mM لكل منهما. استخدموا مانعين للمركب الثالث: antimycin A عند 0.3 micromolar وmyxothiazol عند 1 micromolar. كانت الصبغة بتركيز 2 micromolar في معظم الاختبارات و0.5 في اختبارات cytochrome c. توجد الأنواع الثلاثة مع البروتوكولات المتطابقة في الدراسة مفتوحة الوصول.

تم تجاوز كلا الحاجزين جزئيًا في الأنواع الثلاثة جميعًا. في ميتوكوندريا الفأر، خفّض Antimycin التنفس ورفعت الصبغة مستواه بنحو 60 بالمئة، من قرابة 37 إلى 59 nmol per minute per mg. أما Myxothiazol فخفضه بنسبة 88 بالمئة إلى نحو 4.5، ثم رفعته الصبغة خمسة أضعاف إلى نحو 23. واستعاد جهد الغشاء الاستقطاب جزئيًا مع أي من المثبطين، باستخدام صبغتين (safranin O وratiometric TMRM) لاستبعاد الأخطاء البصرية.

اختبرت هذه الدراسة أيضًا عملية التسليم مباشرة، وهو ما لم تفعله الدراسة الأولى. لم يُختزل acetylated cytochrome c الخارجي عند 25 micromolar بواسطة الميتوكوندريا النشطة مع أو بدون مثبطات، لكن إضافة الصبغة أدت إلى الاختزال في كلتا الحالتين. وفي محلول خالٍ من الخلايا، اختزل NADH مع الصبغة cytochrome c بمعدل يتناسب مع NADH. المسار الأطول بالكلمات: مكافئات الاختزال إلى الصبغة، الصبغة مباشرة إلى cytochrome c، ثم Complex IV إلى الأكسجين. يتجاوز هذا المسار المركب الثالث بالكامل، لذلك يمكن تجاوز كلا المثبطين.

تدعم قراءتان إضافيتان هذا التفسير. انخفض تألق NAD(P)H عند إضافة الصبغة إلى الميتوكوندريا المعالجة بـ myxothiazol، ما يعني أن مكافئات الاختزال استنزفت عبر المسار الجديد. كما تتبّع امتصاص الصبغة عند 660 nm كل إضافة على حدة، بينما أظهرت الرواسب الفائقة بعد الطرد المركزي تراكم الصبغة المؤكسدة داخل الميتوكوندريا النشطة بأكثر من مئة ضعف، ثم خروجها عند انهيار الجهد. تتوافق اقتصاديات البروتون أيضًا: تجاوز خطوات الضخ يترك نحو 2 بروتون لكل زوج إلكترونات بدلًا من 10، لذلك فإن استخدام الأكسجين الأسرع مع استعادة استقطاب جزئية هو ما يبدو عليه التجاوز الحقيقي، وليس دليلًا ضده.

أنتج التحضير نفسه نتائج تجعل القراءة السطحية مضللة. مع المثبط والصبغة، خفّض ADP التنفس بدلًا من رفعه، كما حفّز حجب النقل التنفس بدلًا من إبطائه، بينما تحرك جهد الغشاء في الاتجاهات الطبيعية. استهلاك الأكسجين وحده يعطي قراءة مضللة في هذا النظام.

الدراسة الثالثة: دراسة الكبد التي اختبرت المركبين الأول والثاني، وليس الثالث

استخدم Lee وBoelsterli ميتوكوندريا كبد الفأر وخلايا كبدية مزروعة متضررة بواسطة efavirenz (المركب الأول، IC50 قريب من 30 micromolar) وhydrazine، وهو مستقلب isoniazid (المركب الثاني، IC50 قريب من 30 micromolar). أعادت الصبغة عند نحو 30 micromolar أكسدة NADH وجهد الغشاء وATP مع خفض المؤكسدات والموت النخري. تصف دراسة Redox Biology النموذج على أنه نقل الصبغة للإلكترونات حول المركبين الأول والثاني المتضررين.

هذه النتيجة تمثل سياقًا محسومًا في الجزء العلوي من السلسلة، ولا تقول شيئًا عن المركب الثالث لأن أي شيء لم يُحجب هناك. ولا يمكنها تأكيد أو نفي أي من دراستي الدماغ.

مصفوفة الظروف

أربعة أسباب تجعل دراستي المركب الثالث صحيحتين ضمن إعداد كل منهما

1. لم يكن المثبط هو التدخل نفسه. Antimycin وحده عند 1 microgram per ml مقابل Antimycin عند 0.3 micromolar مع مثبط منفصل لموقع Qo. يفشل مسار الصبغة الذي يغذي موقع Qo تحديدًا حيث ينجح المسار المباشر إلى cytochrome c. ولا يمكن لموقع واحد أن يمثل الاثنين.

2. اختلفت جرعة الصبغة والتوقيت. تركيزات أساسية تبلغ 1 مقابل 2 micromolar، في صبغة تقوم بدورات أكسدة واختزال يعتمد امتصاصها واختزال cytochrome c المباشر على التركيز والزمن. قد تكشف فروق صغيرة في الجرعة مع اختلاف توقيت القياس أجزاء مختلفة من شبكة واحدة.

3. اختلفت التحضيرات. يختار العزل بالديجيتونين مقابل العزل بتدرج Percoll مجموعات ميتوكوندرية متداخلة لكنها غير متطابقة. تطابق تركيز البروتين عند 0.1 mg per ml، لذلك يختفي هذا المتغير، لكن اختلاف المجموعات الفرعية وسلامتها لا يختفي. كما تم استبعاد اختلاف النوع: أعادت المجموعة الثانية إنتاج النمط نفسه في الفأر أيضًا.

4. تحدد حالة الركيزة ما تستطيع الصبغة فعله. ثلاث حالات للركائز مقابل أزواج مرتبطة بـ NADH. يحدد توفر NADH وجهد الغشاء معًا سرعة اختزال الصبغة ومكان توزيعها، والمسار الذي يحتاج صبغة مختزلة بجانب cytochrome c مؤكسد يعتمد على هذا الاختيار.

كيفية قراءة الادعاء التالي حول التجاوز

اسأل أي مركب تم حجبه، وبأي مثبط، وفي أي موقع وبأي جرعة. اسأل عن تركيز الصبغة ومتى تم أخذ القياس. اسأل عن النسيج والنوع والعزل وتركيز البروتين والركيزة. واسأل عما إذا كان الجهد والتنفس وحالة الأكسدة والاختزال واختبار التسليم المباشر تتفق، لأن استهلاك الأكسجين وحده أعطى اتجاهًا خاطئًا أكثر من مرة هنا.

يبقى الملخص الضيق كما هو. تجاوز الصبغة حول المركب الأول متفق عليه. أما حول المركب الثالث، فإن ميتوكوندريا الفأر مع Antimycin عند 1 microgram per ml وصبغة عند 1 micromolar لا تظهر تجاوزًا وظيفيًا، بينما تظهر ثلاثة أنواع مع Antimycin عند 0.3 micromolar أو myxothiazol عند 1 micromolar وصبغة عند 2 micromolar تجاوزًا جزئيًا مع نقل مباشر من الصبغة إلى cytochrome c. تتعايش هذه الجمل. وأي تعميم أوسع منها هو استقراء.

تحافظ القراءة المرتبطة على الادعاء المختلف عليه ضمن الكيمياء غير المختلف عليها: كيف ينقل الميثيلين الأزرق الإلكترونات للمرحل، تجارب تجاوز المركب الأول للحالة العلوية المحسومة، قراءات جهد الغشاء والآثار المصاحبة لها لسبب الحاجة إلى صبغتين، والتعامل المخبري مع دورات الأكسدة والاختزال لتجنب مشكلات الجرعة والتوقيت.