بدائل أزرق الميثيلين للفحص المجهري: اختر حسب المهمة

بالنسبة إلى لطاخة بكتيرية بسيطة، يمكن للبنفسجي البلوري أن يحل محل أزرق الميثيلين عندما يكون الهدف هو رؤية شكل الخلايا. أما بالنسبة إلى الخلايا الحية، فقد يكون البديل الأفضل هو التباين الطوري دون أي صبغة. يعتمد الاختيار على الملاحظة التي تحتاج إلى إجرائها.

افترض أن شخصين يفحصان المزرعة البكتيرية نفسها. يريد أحدهما التمييز بين الخلايا العصوية والخلايا المستديرة. ويريد الآخر معرفة ما إذا كانت معالجة ما قد قتلت البكتيريا. قد تمنح الصبغة الشخص الأول صورة واضحة، لكنها قد لا تمنح الشخص الثاني إجابة قابلة للاستخدام.

قبل اختيار بديل، أكمل هذه الجملة: «أحتاج إلى ملاحظة ___ في ___، ويجب / لا يلزم أن تبقى الخلايا حية.» تحدد هذه الجملة المهمة التي يجب أن تؤديها الصبغة.

ابدأ بالعينة والسؤال

حدد أولاً ما إذا كان يجب أن تبقى الخلايا حية، ثم حدد السمة التي تحتاج إلى ملاحظتها:

• يجب أن تبقى الخلايا حية: للحركة أو الشكل، ضع في الاعتبار التباين الطوري غير المصبوغ أو DIC؛ وللحمض النووي DNA النووي، ضع في الاعتبار Hoechst 33342 مع الفلورية؛ ولسلامة الغشاء، اختر اختباراً متحققاً من صلاحيته مثل SYTO 9 مع يوديد البروبيديوم.
• لا يلزم أن تبقى الخلايا حية: لمورفولوجيا البكتيريا، ضع في الاعتبار صبغة بسيطة بالبنفسجي البلوري أو صبغة سلبية بالنيغروزين؛ ولتفاعل غرام، استخدم طريقة صبغة غرام الكاملة؛ وللحمض النووي DNA النووي في الخلايا المثبتة، ضع في الاعتبار فلورية DAPI. استخدم هذا الجدول لمقارنة قيود كل مسار. هذه اختيارات للطرق، وليست تعليمات لاستبدال عبوات الكواشف ضمن بروتوكول قائم.

بالنسبة إلى اللطاخة البسيطة، استبدل الطريقة بعناية

يُعد البنفسجي البلوري خياراً عملياً عندما تكون المهمة الحصول على صورة أحادية اللون لمورفولوجيا البكتيريا. يسرد دليل التحليل البكتريولوجي التابع لـ FDA تركيبتين من البنفسجي البلوري مناسبتين للصبغ البسيط. استخدم تركيبة موثقة وطريقة تحضيرها؛ فاسم الصبغة وحده لا يحدد كاشفاً جاهزاً للاستخدام.

يظهر البنفسجي البلوري أيضاً في صبغة غرام، لكن ذلك لا يجعل الصبغة البسيطة بالبنفسجي البلوري صبغة غرام. في بروتوكول صبغة غرام من ASM، تعتمد النتيجة التفريقية على عمل البنفسجي البلوري واليود وإزالة اللون والصبغ المضاد بالتتابع. يؤدي حذف هذه الخطوات إلى تغيير ما يمكن للصورة إثباته. راجع الصبغ البسيط مقارنة بصبغة غرام للاطلاع على هذا الفرق.

يقدم النيغروزين طريقة مختلفة لإظهار الحدود: فهو يغمّق الخلفية بينما تبقى الخلايا البكتيرية فاتحة نسبياً. توجد ملاحظة مفيدة في تعليمات Merck الخاصة بالنيغروزين قد لا تظهر في قائمة عامة للبدائل. فالتركيبة المحددة للاستخدام تحتوي على الفورمالديهايد. لذلك لا يمكنك استنتاج التوافق مع الخلايا الحية من عبارة «صبغة سلبية»، حتى وإن بدت الخلايا نفسها غير مصبوغة. تحقق من التركيبة الكاملة ومن تحضير العينة.

بالنسبة إلى العينات الحية، فكّر في تغيير البصريات

إذا كنت تريد مشاهدة الخلايا وهي تتحرك أو تنقسم، فقد يؤدي إدخال صبغة أخرى إلى تعقيد الملاحظة. كما توضح Nikon في دليلها حول التباين في العينات الشفافة، يجعل التباين الطوري وتباين التداخل التفاضلي، أو DIC، العينات مرئية من خلال الاختلافات في خصائصها البصرية. ويمكنهما إظهار الخلايا الحية غير المصبوغة، بشرط أن يحتوي المجهر على المكونات المطلوبة.

يحافظ هذا الخيار على تحضير غير مصبوغ، لكنه يغيّر المعلومات المتاحة. يمكنك تتبع حد أو حركة دون معرفة الجزيء الذي أنتج التباين. إذا كان السؤال يتعلق بالتموضع الجزيئي، فاختر بدلاً من ذلك طريقة وسم مناسبة.

بالنسبة إلى الحمض النووي DNA النووي، تميز مقارنة Invitrogen بين صبغتي DAPI وHoechst بين الاستخدام الشائع لـ DAPI مع الخلايا المثبتة وبين Hoechst 33342 الأكثر قدرة على النفاذ إلى الخلايا، والذي يُفضّل لوسم الخلايا الحية. كلاهما يتطلب معدات فلورية. ولا يُعد أي منهما بديلاً مباشراً لصبغة ملونة للمجال الساطع.

تعامل مع التعرض للصبغة والإضاءة بوصفهما من ظروف التجربة. قارن التحضيرات المصبوغة وغير المصبوغة عندما يكون سلوك الخلايا هو القياس الذي تعتمد عليه.

الخلية الحمراء ليست بالضرورة خلية ميتة

غالباً ما يُستخدم SYTO 9 ويوديد البروبيديوم معاً لتقييم سلامة غشاء البكتيريا. يربط دليل BacLight الأغشية السليمة بالصبغ الأخضر والأغشية المتضررة بالصبغ الأحمر. ويتطلب هذا التفسير التحقق من صلاحيته للعينة المعنية.

توضح دراسة أُجريت عام 2019 بواسطة Rosenberg وزملائه المشكلة. ففي الأغشية الحيوية لـ E. coli بعمر 24-hour على الزجاج في محلول ملحي منظم بالفوسفات، ظهر نحو 96% من الخلايا موجبة ليوديد البروبيديوم في موضعها. ومع ذلك، قدّر الباحثون أن 82% منها كانت قابلة للزراعة بعد جمعها. وأظهرت الصور المجهرية متحد البؤر خلايا ذات مناطق داخلية خضراء تحت مادة مصبوغة بالأحمر، مما يشير إلى تورط الأحماض النووية خارج الخلية في الإشارة المضللة.

تصف هذه النسب المئوية قياسات مختلفة أُجريت على تحضيرات الدراسة، وليست معامل تصحيح عاماً. والدرس المفيد هو التحقق مما ولّد الإشارة. ففي الغشاء الحيوي، يمكن لصبغة الأحماض النووية اكتشاف مادة خارج الخلايا وكذلك داخل الخلايا المتضررة. وللوصول إلى استنتاج بشأن قابلية الخلايا للحياة، يوصي الباحثون بقياسات تكميلية، مثل الزراعة أو النشاط الأيضي، مع الإقرار بأن لكل منها قيوداً.

تحقق مما يحتويه البديل فعلياً

قد تظل طريقة الصبغ البديلة محتوية على أزرق الميثيلين. وصبغة Giemsa مثال على ذلك: تصف Merck منتجها بأنه محلول أزور-إيوزين-أزرق الميثيلين، مخصص لتطبيقات تشمل لطاخات الدم ونخاع العظم. وقد يكون طريقة مختلفة لعينة مختلفة، لكنه لا يفي بمتطلب استبعاد أزرق الميثيلين.

إذا كان استبعاد مركب ما جزءاً من التجربة، فتحقق من هوية الكاشف وتركيبته قبل مقارنة الصور. ويتناول دليل أزرق الميثيل، وأزرق الميثيلين، والأصباغ ذات الأسماء المتشابهة اختلافات التسمية.

تحقق من صلاحية الاستبدال قبل استخدام النتيجة

بالنسبة إلى طريقة جديدة، أجرِ مقارنة صغيرة باستخدام عينات ممثلة وضابط مناسب. حافظ على إعدادات المجهر قابلة للمقارنة حيثما أمكن. وسجّل تركيبة الكاشف وتحضير العينة والتعرض وظروف التصوير، بحيث يمكن التحقق من سبب ظهور صورة أفضل بدلاً من الاكتفاء بتفضيلها.

قيّم النجاح مقارنة بالسؤال الأصلي. بالنسبة إلى المورفولوجيا، قيّم ما إذا كانت حدود الخلايا وترتيبها تظل قابلة للتفسير. وبالنسبة إلى الوسم النووي، قيّم موضع الإشارة والخلفية. وبالنسبة إلى قابلية الخلايا للحياة، اطلب دليلاً يتجاوز مجرد الفصل اللوني الجذاب. يوضح الدليل الأشمل حول صبغ أزرق الميثيلين وتطبيقاته المختبرية كيفية تكامل الملاحظة مع التحضير.

اختر البديل الذي يحافظ على القياس الذي تحتاج إليه. فاللون ليس سوى خاصية واحدة من خصائص الصورة الناتجة.