显微镜检查中的亚甲蓝替代方案

对于简单的细菌涂片，如果目的是观察细胞形态，可以用结晶紫替代亚甲蓝。对于活细胞，更合适的替代方案可能是不使用任何染色剂的相差显微成像。具体选择取决于需要进行的观察。

假设两个人正在检查同一份细菌培养物。一个人想区分杆状细胞和圆形细胞，另一个人想知道某种处理是否杀死了细菌。能够让前者获得清晰图像的染色方法，可能无法为后者提供可用的答案。

选择替代方案之前，先完成这句话：“我需要在 ___ 中观察 ___，并且细胞必须 / 不必保持存活。” 这句话定义了染色方法需要完成的任务。

从样本和问题开始

首先确定细胞是否必须保持存活，然后明确需要观察的特征：

细胞必须保持存活：对于运动或形态，可考虑无染色的相差显微成像或 DIC；对于核 DNA，可考虑配合荧光成像使用 Hoechst 33342；对于膜完整性，应选择经过验证的检测方法，例如 SYTO 9 与 propidium iodide 的组合。
细胞不必保持存活：对于细菌形态，可考虑结晶紫简单染色或尼格罗辛负染色；对于革兰氏反应，应使用完整的革兰氏染色方法；对于固定细胞中的核 DNA，可考虑 DAPI 荧光成像。

使用下表比较各个分支的局限性。这些是方法选择，并不是在现有实验方案中直接更换试剂瓶的说明。

需要观察的内容	样本和设备	候选替代方案	主要局限
细菌形态和排列	制备好的细菌涂片；明场	结晶紫简单染色	可显示形态；不能确定革兰氏反应或存活性。
深色背景下的细胞轮廓	细菌学制备样本；明场	尼格罗辛负染色	制备方式和配方很重要；未染色的细胞不一定是活细胞。
革兰氏反应	制备好的细菌涂片；明场	完整的革兰氏染色方法	需要完整的试剂步骤和对照。
活细胞的运动或变化	兼容的湿片制备；相差或 DIC	不染色	需要合适的光学系统；对比度不能识别具体分子。
核 DNA	固定细胞；荧光	DAPI	需要兼容的激发和发射滤光片。
活细胞中的核 DNA	活细胞；荧光	Hoechst 33342	能进入细胞并不能证明成像条件对细胞无害。
细菌膜完整性	未固定细菌；荧光	SYTO 9 与 propidium iodide	膜染色是对存活性的间接测量。

对于简单涂片，应谨慎替换方法

当任务是以单一颜色观察细菌形态时，结晶紫是一种实用的候选方案。FDA 的《Bacteriological Analytical Manual》列出了两种适用于简单染色的结晶紫配方。应使用有文档记录的配方及其制备方法；仅凭染料名称并不能确定实际使用的工作试剂。

结晶紫也用于革兰氏染色，但这并不意味着结晶紫简单染色就是革兰氏染色。在 ASM 革兰氏染色实验方案中，鉴别结果取决于结晶紫、碘液、脱色和复染按顺序共同发挥作用。省略这些步骤会改变图像能够证明的内容。有关这一差异，请参阅简单染色与革兰氏染色。

尼格罗辛提供了另一种显示轮廓的方法：它使背景变暗，而细菌细胞本身相对较亮。Merck 的尼格罗辛说明中有一个容易被通用替代方案列表忽略的重要细节：其指定工作配方含有甲醛。因此，即使细胞本身看起来未被染色，也不能仅根据“负染色”这一名称推断其适用于活细胞。应检查完整配方和样本制备方法。

对于活体样本，可考虑改变光学成像方式

如果希望观察细胞运动或分裂，引入另一种染料可能反而使观察变得复杂。正如 Nikon 在其透明样本对比度指南中所解释的，相差和微分干涉对比（DIC）通过样本光学性质的差异使其可见。只要显微镜配备所需组件，这些方法就可以观察未染色的活细胞。

这种选择能够保留未染色的样本制备状态，但会改变可获得的信息。你可以追踪边界或运动，却无法由此得知是哪种分子产生了对比度。如果问题是分子的空间定位，则应改用合适的标记方法。

对于核 DNA，Invitrogen 的 DAPI 与 Hoechst 染料比较区分了通常用于固定细胞的 DAPI，以及细胞通透性更高、通常用于活细胞标记的 Hoechst 33342。两者都需要荧光设备。它们都不能直接替代用于明场观察的有色染料。

应将染料暴露和照明条件视为实验条件。如果测量对象是细胞行为，应比较染色和未染色的样本。

红色细胞并不一定就是死细胞

SYTO 9 和 propidium iodide 常被配对用于评估细菌膜完整性。BacLight 手册将完整细胞膜与绿色染色相关联，将受损细胞膜与红色染色相关联。对于具体样本，这种解释需要经过验证。

Rosenberg 及其同事于 2019 年发表的一项研究说明了其中的问题。在玻璃表面、磷酸盐缓冲盐水中的 24-hour E. coli 生物膜中，原位观察约 96% 的细胞呈 propidium-iodide 阳性。然而，作者估计在收集样本后，其中 82% 仍可培养。共聚焦图像显示，红色染色物质下方存在内部呈绿色的细胞，这表明细胞外核酸可能造成误导性信号。

这些百分比描述的是该研究样本上不同测量方法所得的结果，并不是通用的修正系数。真正有用的结论是，应检查信号实际来自什么。在生物膜中，核酸染料既可能检测受损细胞内部的物质，也可能检测细胞外部的物质。如果要得出存活性结论，研究人员建议结合其他测量，例如培养或代谢活性，同时也指出每种方法都有其局限性。

检查替代方案实际包含什么

替代染色方法仍有可能含有亚甲蓝。Giemsa 就是一个例子：Merck 将其产品描述为一种azure-eosin-methylene-blue 溶液，应用范围包括血液和骨髓涂片。对于不同样本，它可以是一种不同的方法，但如果要求排除亚甲蓝，它并不符合这一要求。

如果实验要求排除某种化合物，应在比较图像之前检查试剂身份和配方。关于名称差异，可参阅甲基蓝、亚甲蓝及名称相似染料指南。

使用结果之前验证替换方法

对于一种新方法，应使用有代表性的样本和适当的对照进行小规模比较。在可能的情况下，保持显微镜设置具有可比性。记录试剂配方、样本制备、暴露条件和成像条件，这样，当某幅图像看起来更好时，可以进一步调查原因，而不是仅凭外观作出偏好判断。

应根据最初的问题判断是否成功。对于形态观察，应评估细胞边界和排列是否仍然可以清楚解释。对于核标记，应评估信号位置和背景。对于存活性判断，仅有醒目的颜色区分并不足以作为证据。更全面的亚甲蓝染色和实验室应用指南介绍了观察目标与样本制备之间的关系。

选择能够保留所需测量信息的替代方案。颜色只是最终图像的一个属性。