亚甲蓝能绕过线粒体复合体 III 吗？为什么研究结果存在分歧

两个实验室研究了同一个问题：亚甲蓝是否可以绕过被阻断的线粒体复合体 III。一个答案是否定的。另一个答案是肯定的。两者都有数据支持。

第一项研究使用小鼠脑线粒体，发现该染料无法绕过。第二项研究使用三种啮齿动物的脑线粒体，发现它可以部分绕过。第三项研究使用小鼠肝脏，经常被放在附近引用，但它测试的是另一件事。将其放在正确的位置，很多混淆就会消失。

没有一个普遍适用的机制可以直接宣布。这里有三个实验，它们使用了不同的阻断剂、剂量和检测指标。先看实验条件，再看结论。

这里的“绕过”是什么意思

电子通过复合体 I（来自 NADH）或复合体 II（来自琥珀酸）进入电子传递链，经过复合体 III 到达细胞色素 c，然后通过复合体 IV 到达氧气。沿途建立的梯度是细胞用于制造 ATP 的能量来源。

绕过机制的说法是，亚甲蓝可以从阻断点上游获取电子，并将其传递到下游。氧化态染料从 NADH 或电子链早期组分获取电子，变为还原型亚甲蓝，而还原形式将电子传递给细胞色素 c 或重新进入电子链。如果电子交接发生在阻断点下游，呼吸作用和膜电位会部分恢复。如果发生在阻断点处或上游，则不会恢复。

复合体 III 的一个细节决定了这场争议的大部分内容。该复合体通过两个抑制剂位点运行 Q 循环。Antimycin 结合 Qi 位点。Myxothiazol 结合 Qo 位点。只使用其中一种的研究，只测试了该复合体的一半。

研究一：小鼠脑线粒体中不存在绕过复合体 III

Gureev 及其同事使用 C57BL/6 小鼠的大脑皮层线粒体，通过 digitonin 分离，在每毫升 0.1 mg 蛋白质条件下进行检测。底物覆盖三个状态：丙酮酸加苹果酸（各 5 mM）、琥珀酸（10 mM）加谷氨酸（2 mM），以及 L-脯氨酸（10 mM）。阻断剂为 rotenone（1 micromolar，复合体 I）和 antimycin（1 microgram per ml，复合体 III）。染料剂量为 0.5、1 和 2 micromolar，其中 1 micromolar 为主要浓度。方法和曲线见 FEBS Letters communication。

复合体 I 绕过有效。Rotenone 将 ADP 刺激的呼吸从约 121 降至约 2 nmol per minute per mg，而 1 micromolar 染料将其恢复至约 21。在丙酮酸加苹果酸以及 L-脯氨酸条件下，膜电位恢复。

复合体 III 绕过无效。Antimycin 将呼吸降低至约 16，而染料仅将其提高至约 20。在所有底物条件下，膜电位均未恢复，即使染料剂量提高至 5 micromolar。过氧化物数据也支持同一结论：单独染料使过氧化物释放从接近 76 pmol per minute per mg 的基础速率提高到三个剂量下约 1170、1460 和 1945，但 antimycin 分别使该染料驱动信号降低约 25%、88% 和 96%。如果还原型染料直接与氧反应，阻断复合体 III 不应抑制该信号。作者推断，还原型染料在复合体 III 的 Qo 位点被氧化，该位置位于 antimycin 阻断点上游。简化来说：供体到染料，染料到 Qo，继续正常路径。Rotenone 可以绕过。Antimycin 不可以。

研究二：三种物种中两个抑制位点均存在部分绕过

Svab 及其同事扩大了实验设计。他们使用小鼠、大鼠和豚鼠的脑线粒体，通过 Percoll 分离，在相同的 0.1 mg per ml 条件下检测，底物为丙酮酸加苹果酸或谷氨酸加苹果酸（各 5 mM）。他们使用两种复合体 III 阻断剂：antimycin A（0.3 micromolar）和 myxothiazol（1 micromolar）。大多数实验使用 2 micromolar 染料，细胞色素 c 实验使用 0.5 micromolar。三种物种采用匹配方案的完整研究见 open access paper。

在三种物种中，两种阻断均可被部分绕过。在小鼠线粒体中，antimycin 抑制呼吸，而染料使其提高约 60%，从约 37 提高到 59 nmol per minute per mg。Myxothiazol 抑制 88%，降至约 4.5，而染料使其提高五倍至约 23。膜电位在任一抑制剂条件下均部分重新极化，使用两种染料（safranin O 和比率型 TMRM）检测，以排除光学伪影。

该研究还直接测试了电子交接，而第一项研究没有进行这一检测。在有能量供应的线粒体中，无论是否存在抑制剂，25 micromolar 外源乙酰化细胞色素 c 均未被还原，但加入染料后两种情况下均出现还原。在无细胞缓冲液中，NADH 加染料以与 NADH 成比例的速率还原细胞色素 c。更长距离的跳转可以表示为：还原当量到染料，染料直接到细胞色素 c，复合体 IV 到氧气。该路径完全跳过复合体 III，因此两种阻断剂均可被绕过。

另外两个检测指标支持这一解释。向经过 myxothiazol 处理的线粒体加入染料后，NAD(P)H 荧光下降，说明还原当量通过新路径流动。并且，660 nm 处的染料吸光度随着每次加入而变化，同时离心后的上清显示，氧化型染料在具有能量供应的线粒体内部富集超过百倍，随后在膜电位崩溃时离开。质子能量学也符合该解释：跳过泵出步骤后，每对电子转移大约留下 2 个质子，而不是 10 个，因此更快的耗氧伴随仅部分膜电位恢复，正是真实绕过机制的表现，而不是反对绕过的证据。

同一实验体系产生了一些容易误读的结果。在抑制剂加染料条件下，ADP 降低呼吸，而不是提高呼吸；运输阻断促进呼吸，而不是减慢呼吸；同时膜电位仍按正常方向变化。在该体系中，仅依靠耗氧量会产生误导。

研究三：测试的是复合体 I 和 II，而不是 III 的肝脏研究

Lee 和 Boelsterli 使用小鼠肝脏线粒体以及由 efavirenz（复合体 I，IC50 接近 30 micromolar）和 hydrazine（异烟肼代谢物，复合体 II，IC50 接近 30 micromolar）损伤的培养肝细胞。约 30 micromolar 染料恢复了 NADH 氧化、膜电位和 ATP，同时降低氧化物和坏死性死亡。该 Redox Biology paper 将其模型描述为染料携带电子绕过受损的复合体 I 和 II。

这一结果提供了上游背景，并未涉及复合体 III，因为其中没有阻断复合体 III。它不能确认或否定两项脑线粒体研究中的任何一个结论。

条件矩阵

四个原因说明两项复合体 III 研究可以同时适用于各自实验条件

1. 阻断剂并不是同一种干预。 Antimycin 单独以 1 microgram per ml 对抗，与 antimycin 0.3 micromolar 加另一种 Qo 位点阻断剂不同。如果染料路径向 Qo 位点供电子，那么它会在这里失败，而直接传递到细胞色素 c 的路径会成功。一个位点不能代表两个位点。

2. 染料剂量和时间过程不同。 主要浓度分别为 1 和 2 micromolar，而氧化还原循环过程中的摄取和直接细胞色素 c 还原依赖浓度和时间。小剂量差异加上不同检测时间点，可以暴露同一网络中的不同环节。

3. 制备方式不同。 Digitonin 分离与 Percoll 梯度分离会选择重叠但并不完全相同的线粒体群体。蛋白浓度均匹配为 0.1 mg per ml，因此该变量被排除，但亚群体和完整性仍然存在差异。并且物种因素已被排除：第二组也在小鼠中重复观察到了该现象。

4. 底物状态决定染料能够发挥什么作用。 三种底物状态与 NADH 相关组合不同。NADH 供应和膜电位共同决定染料还原速度以及其分布位置，而需要还原型染料靠近氧化型细胞色素 c 的路径取决于这一选择。

如何阅读下一项绕过机制研究

询问哪个复合体被阻断，使用了哪种抑制剂、哪个位点以及什么剂量。询问染料浓度以及检测时间。询问组织、物种、分离方法、蛋白浓度和底物。还要询问膜电位、呼吸、氧化还原状态以及直接交接实验是否一致，因为在这里耗氧量不止一次指向了错误方向。

狭义总结如下。染料绕过复合体 I 已达成共识。对于复合体 III，小鼠线粒体在 antimycin 1 microgram per ml 和染料 1 micromolar 条件下未显示功能性绕过，而三种物种在 antimycin 0.3 micromolar 或 myxothiazol 1 micromolar 与染料 2 micromolar 条件下显示部分绕过，并存在染料直接向细胞色素 c 转移的过程。这些陈述可以同时成立。任何更广泛的结论都属于外推。

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