Xanh methylene trong xét nghiệm G6PD: thuốc nhuộm thực sự làm gì?

Một sinh viên quan sát hai ống nghiệm sau khi ủ. Một ống đã chuyển sang màu dự kiến. Ống còn lại thì không. Sinh viên kết luận rằng bệnh nhân thứ hai bị thiếu glucose-6-phosphate dehydrogenase. Kết luận đó có thể đúng, nhưng cách suy luận đã bỏ qua khái niệm cốt lõi giúp xét nghiệm hoạt động. Không có gì trong ống nghiệm đo trực tiếp enzym. Ống nghiệm đo sản phẩm do enzym tạo ra, với xanh methylene đóng vai trò trung gian.

Khi hiểu rõ cơ chế gián tiếp này, quy trình, các mẫu đối chứng và danh sách dài những kết quả sai lệch sẽ không còn có vẻ tùy tiện.

Câu trả lời ngắn gọn

Xanh methylene trong xét nghiệm G6PD là chất chỉ thị oxy hóa–khử. Enzym G6PD tạo ra NADPH, và các hệ thống phụ thuộc NADPH khử xanh methylene màu xanh thành dạng leuco không màu của nó (hoặc dùng chất này để vận chuyển electron). Hoạt tính enzym bình thường giúp quá trình khử diễn ra hiệu quả. Hoạt tính thiếu hụt khiến quá trình khử chậm hoặc không hoàn toàn. Đó là toàn bộ tín hiệu của xét nghiệm.

Hai phương pháp được sử dụng trước đây dùng cùng thuốc nhuộm nhưng khác nhau về điểm cuối. Phân biệt rõ hai phương pháp này sẽ giải quyết phần lớn sự nhầm lẫn.

Hai xét nghiệm, một thuốc nhuộm, các điểm cuối khác nhau

Phương pháp thứ nhất là xét nghiệm khử xanh methylene trực tiếp, do Sass và cộng sự mô tả, sau đó được Gibbs đánh giá. Ở đây, điểm cuối chính là thuốc nhuộm: xanh methylene ở dạng oxy hóa có màu xanh được khử thành leucomethylene blue không màu, và tốc độ thay đổi này phản ánh khả năng tạo NADPH. Bài báo gốc về phương pháp sàng lọc này được lập chỉ mục trên PubMed dưới tên Sass và cộng sự (1966).

Phương pháp thứ hai là xét nghiệm khử methemoglobin Brewer. Trước tiên, natri nitrit oxy hóa hemoglobin thành methemoglobin màu nâu. Sau đó, xanh methylene đóng vai trò chất trung gian chuyển electron: xanh methylene ở dạng khử truyền các đương lượng khử cho methemoglobin, chuyển chất này trở lại thành hemoglobin màu đỏ. Vì vậy, điểm cuối quan sát được là màu nâu so với màu đỏ, không phải màu xanh so với không màu. Phương pháp gốc được công bố trong Bản tin của Tổ chức Y tế Thế giới (Brewer và cộng sự, 1960).

Gọi xét nghiệm Brewer là xét nghiệm làm mất màu thuốc nhuộm là không chính xác về mặt hóa học. Thuốc nhuộm luân chuyển giữa các trạng thái; hemoglobin mới là chất đổi màu. Sơ đồ dưới đây mô tả cả hai con đường.

Phản ứng nền tảng

G6PD xúc tác bước oxy hóa đầu tiên của con đường pentose phosphate:

Glucose-6-phosphate + NADP+ tạo thành 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Hồng cầu trưởng thành phụ thuộc rất nhiều vào con đường này để tạo NADPH, như được tổng quan trong bài viết của Luzzatto và cộng sự trên Blood (2020). NADPH duy trì glutathione ở trạng thái khử và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa. Xanh methylene tham gia hệ thống này với vai trò chất nhận electron. G6PD đầy đủ tạo ra đủ NADPH, từ đó giúp quá trình khử diễn ra hiệu quả. G6PD thấp làm đứt chuỗi ngay tại mắt xích đầu tiên.

Hãy hình dung thuốc nhuộm như đồng hồ báo nhiên liệu, không phải động cơ. Nó phản ánh nguồn cung NADPH. Bất kỳ yếu tố nào khác làm thay đổi nguồn cung đó hoặc tín hiệu đo đều có thể làm kim đồng hồ dịch chuyển mà không có thay đổi nào ở gen.

Quy trình kiểu Brewer diễn ra như thế nào?

Công thức thuốc thử đã thay đổi qua nhiều thập kỷ, vì vậy không được nhầm một mô tả dùng cho giảng dạy với quy trình lâm sàng. Mỗi phòng xét nghiệm tuân theo quy trình thao tác chuẩn đã được thẩm định riêng. Với lưu ý đó, cách bố trí ống nghiệm cổ điển diễn ra như sau, theo dạng dùng ba ống nghiệm và ủ trong 3 giờ được ghi nhận trong quy trình triển khai đã công bố này:

1. Ống mẫu bệnh nhân: máu toàn phần cùng glucose, natri nitrit và xanh methylene. Nitrit tạo methemoglobin, glucose cung cấp cơ chất cho chuyển hóa hồng cầu, còn thuốc nhuộm đảm nhiệm vai trò vận chuyển electron phụ thuộc NADPH.
2. Đối chứng oxy hóa: máu cùng nitrit và glucose nhưng không có xanh methylene. Ống này thể hiện điểm cuối methemoglobin màu nâu, tương ứng với mẫu hình thiếu hụt.
3. Đối chứng hemoglobin: máu cùng nước. Ống này thể hiện điểm cuối hemoglobin màu đỏ, tương ứng với mẫu hình bình thường.
4. Ủ tất cả các ống ở khoảng 37 C, thường trong 3 giờ, trộn nhẹ.
5. Pha loãng một phần nhỏ mẫu từ mỗi ống vào nước cất để ly giải tế bào và giúp dễ so sánh màu.
6. So sánh ống mẫu bệnh nhân với hai ống đối chứng. Màu chuyển trở lại gần màu đỏ cho thấy khả năng khử đáng kể. Màu vẫn gần màu nâu gợi ý tình trạng thiếu hụt rõ rệt.

Một công thức trước đây dùng khoảng 1 mL máu với các thuốc thử có nồng độ xấp xỉ 180 mM natri nitrit, 280 mM dextrose và 0.4 mM xanh methylene. Hãy xem các con số này là một ví dụ trong tài liệu, không phải thông số áp dụng chung.

Đọc kết quả

Xét nghiệm sàng lọc định tính phân biệt tốt nhất ở khoảng 30 đến 40 phần trăm hoạt tính bình thường, như được thảo luận trong bài tổng quan trên Malaria Journal về những khoảng trống trong phát hiện thiếu hụt G6PD. Vì vậy, kết quả sàng lọc bình thường có nghĩa là xét nghiệm không phát hiện tình trạng thiếu hụt nặng. Kết quả đó không xác nhận hoạt tính hoàn toàn bình thường.

Vì sao sàng lọc có thể gây hiểu lầm?

Tăng hồng cầu lưới sau tan máu là nguyên nhân điển hình gây kết quả bình thường giả. Hồng cầu non và hồng cầu lưới chứa nhiều G6PD hơn hồng cầu già. Trong một đợt tan máu cấp, những tế bào già nhất và thiếu hụt nhiều nhất có thể đã bị phá hủy, để lại quần thể tế bào trẻ có hoạt tính cho kết quả bình thường. Cơ chế sinh học này cũng gây sai lệch cho xét nghiệm định lượng, không chỉ cho sàng lọc bằng thuốc nhuộm.

Truyền máu gần đây che lấp tình trạng thiếu hụt vì hồng cầu của người cho góp enzym của chúng vào mẫu xét nghiệm. Mayo Clinic Laboratories liệt kê truyền máu trong số các nguyên nhân khiến kết quả enzym không đáng tin cậy, cùng với tăng hồng cầu lưới và nhiễu do bạch cầu.

Nữ giới dị hợp tử là trường hợp khó đánh giá nhất. Sự bất hoạt ngẫu nhiên nhiễm sắc thể X tạo ra hỗn hợp hồng cầu bình thường và hồng cầu thiếu hụt, khiến hoạt tính tổng thể có thể nằm ở bất kỳ mức nào, từ thiếu hụt nặng đến có vẻ bình thường. Xét nghiệm sàng lọc định tính thường bỏ sót các kiểu hình trung gian. Tài liệu của WHO về xét nghiệm G6PD thảo luận chi tiết về hạn chế này.

Thời gian kể từ khi lấy mẫu, nhiệt độ bảo quản, tính chủ quan khi đánh giá điểm cuối bằng mắt, hematocrit và chất lượng thuốc thử làm tăng nhiễu phân tích bên cạnh những ảnh hưởng sinh học này.

Sàng lọc không phải là chẩn đoán

Kết quả sàng lọc cho thấy thiếu hụt, mức trung gian hoặc không phù hợp với biểu hiện lâm sàng cần được kiểm tra bằng xét nghiệm định lượng enzym G6PD. WHO xem phép đo quang phổ định lượng có kiểm soát nhiệt độ là phương pháp tham chiếu. Trong xét nghiệm đó, glucose-6-phosphate và NADP+ được thêm vào dịch ly giải hồng cầu, và NADPH hình thành được theo dõi qua sự tăng độ hấp thụ ở 340 nm. Tốc độ thay đổi tỷ lệ thuận với hoạt tính enzym, thường được chuẩn hóa theo hemoglobin dưới dạng đơn vị trên mỗi gam. Thực hành hiện nay trong phòng xét nghiệm lâm sàng được tóm tắt trong mục danh mục xét nghiệm Mayo về hoạt tính G6PD.

Việc diễn giải sử dụng khoảng tham chiếu đã được phòng xét nghiệm thẩm định, thường được biểu thị tương đối so với hoạt tính bình thường của quần thể; tình trạng thiếu hụt thường được xem xét quanh ngưỡng 30 phần trăm, còn hoạt tính trung gian nằm trên ngưỡng đó. Hồ sơ đặc tính sản phẩm mục tiêu của WHO cho xét nghiệm G6PD (2022) trình bày khuôn khổ chẩn đoán này. Nếu tan máu hoặc truyền máu gần đây khiến việc xác định kiểu hình không đáng tin cậy, cần xét nghiệm lại sau khi quần thể hồng cầu tái lập cân bằng; xét nghiệm phân tử có thể bổ sung thông tin nhưng không thay thế phép đo enzym.

Một ranh giới cần giữ rõ

Xanh methylene trong các xét nghiệm này là thuốc thử phòng xét nghiệm ex vivo. Đây là vấn đề khác với tính an toàn khi đưa xanh methylene vào cơ thể bệnh nhân, vốn được đề cập trong hướng dẫn về chống chỉ định của xanh methylene. Hai vấn đề có liên hệ về mặt sinh hóa, vì thuốc cũng phụ thuộc vào quá trình khử dựa trên NADPH, nhưng thuốc nhuộm trong ống nghiệm không phải là một liều thuốc trong dòng máu. Để tìm hiểu cách thuốc nhuộm hoạt động như một chất nhuộm trong bối cảnh khác, xem nguyên lý nhuộm bằng xanh methylene; còn để hiểu nhóm hóa học mà chất này thuộc về, hãy tìm hiểu các thuốc nhuộm oxy hóa–khử trong phòng xét nghiệm.

Sàng lọc đặt câu hỏi liệu khả năng khử có vẻ còn nguyên vẹn hay không. Xét nghiệm xác nhận đặt câu hỏi thực sự có bao nhiêu enzym. Thuốc nhuộm đáp ứng tốt câu hỏi thứ nhất, miễn là không ai yêu cầu nó trả lời câu hỏi thứ hai.