Thử nghiệm nấm men bằng xanh methylen: đếm tế bào sống và đo thời gian hô hấp

Hai ống nghiệm đặt trên bàn. Cả hai đều có màu xanh. Trong một phép thử, tế bào màu xanh dưới kính hiển vi biểu thị nấm men đã chết. Trong phép thử còn lại, ống nghiệm chuyển từ xanh sang không màu biểu thị nấm men còn sống và đang hô hấp. Cùng một thuốc nhuộm, nhưng cách đọc kết quả trái ngược nhau. Nhầm lẫn hai phép thử này sẽ đảo ngược mọi kết luận.

Sự khác biệt đó là trọng tâm của bài viết. Xanh methylen là thuốc nhuộm oxy hóa–khử: ở dạng oxy hóa, nó có màu xanh; ở dạng khử, nó là leucomethylene blue không màu. Phép đếm khả năng sống tận dụng tính chất hóa học này trong một lần quan sát nhanh dưới kính hiển vi. Thí nghiệm hô hấp tận dụng nó trong phản ứng của toàn bộ mẫu được theo dõi theo thời gian. Mỗi phép thử cần quy trình riêng, đối chứng riêng và cách xem xét kết quả một cách thận trọng riêng.

Phép đếm khả năng sống: nhuộm ngắn, đọc kết quả ngay

Quy trình dùng trong sản xuất bia là phiên bản được chuẩn hóa nhất. Chuẩn bị xanh methylen 0.01% w/v trong natri citrat 2%, trộn theo tỷ lệ 1:1 với huyền phù nấm men rồi quan sát hỗn hợp sau một khoảng thời gian ngắn cố định. Khoảng thời gian được công bố dao động từ 1 đến 2 phút trong sổ tay của Brewing Science Institute đến khoảng 5 phút trong các quy trình nghiên cứu; phương pháp vi sinh vật học rượu vang của OIV yêu cầu quan sát trong vòng 10 phút. Nồng độ thuốc nhuộm cuối cùng trong hỗn hợp đếm gần 0.005%. Nạp mẫu vào buồng đếm Neubauer cải tiến và, ở độ phóng đại khoảng 400x, phân loại tế bào xanh đậm là không còn khả năng sống, tế bào không nhuộm màu là còn khả năng sống. Phương pháp OIV tính tế bào xanh nhạt là còn sống, điều này đã gợi mở vấn đề chủ quan sẽ được bàn đến bên dưới.

Nồng độ tế bào được tính từ kích thước hình học của buồng đếm. Khi đếm toàn bộ ô vuông trung tâm cạnh 1 mm, số tế bào trên mỗi mL bằng N nhân hệ số pha loãng nhân 10^4, trong đó N là số tế bào đếm được trong vùng đó, như trình bày trong các phương pháp về nấm men của ASBC. Tỷ lệ sống được tính đơn giản hơn: số tế bào không nhuộm màu chia cho tổng số tế bào, nhân 100. Đếm khoảng 400 tế bào để ước tính tỷ lệ sống, theo nghiên cứu so sánh trong sản xuất bia của FEMS và thực hành của OIV. Áp dụng nhất quán một quy tắc đếm trên đường biên, chẳng hạn tính các tế bào nằm trên đường lưới phía dưới và bên trái, bỏ qua các tế bào nằm trên đường lưới phía trên và bên phải.

Cần xác định quy tắc đếm chồi trước khi bắt đầu. Một quy ước phổ biến là tính chồi thành một tế bào riêng khi kích thước của nó đạt khoảng một nửa tế bào mẹ; nếu nhỏ hơn mức đó thì tính chung với tế bào mẹ. Dù chọn quy tắc nào, hãy áp dụng cho mọi ô vuông và ghi lên phiếu đếm để người tiếp theo có thể làm giống như vậy.

Phiếu đếm tế bào (in phiếu này)

Phiếu này được thiết kế riêng cho bài viết. Hãy chép vào sổ tay hoặc in một phiếu cho mỗi mẫu.

Tỷ lệ sống (%) = 100 x số tế bào không nhuộm màu / (số tế bào không nhuộm màu + số tế bào xanh đậm). Tổng số tế bào trên mỗi mL = N x hệ số pha loãng x 10^4, với N lấy từ vùng buồng đếm đã xác định. Ghi thời gian nhuộm bên cạnh kết quả, vì một giá trị tỷ lệ sống không kèm thời gian nhuộm thì không thể tái lập.

Vì sao kết quả tỷ lệ sống thay đổi

Thời gian là yếu tố gây nhiễu đầu tiên, và nó tác động theo cả hai hướng. Tế bào đang hoạt động chuyển hóa sẽ khử thuốc nhuộm, nên đọc quá sớm có thể quan sát tế bào sống trước khi chúng khử xong thuốc nhuộm và phân loại nhầm thành tế bào chết. Nhưng tiếp xúc kéo dài tự nó cũng gây độc và tạo ra các tế bào xanh thực sự bị tổn thương, dẫn đến kết quả nhuộm đánh giá sai tình trạng chết. Vì vậy, một quy trình giảng dạy trong phòng thí nghiệm yêu cầu phân loại trong vòng 5 phút, như ghi trong quy trình giảng dạy về nấm men của Wisconsin. Cách diễn đạt thận trọng là kết quả phân loại bằng xanh methylen phụ thuộc vào thời gian, vì vậy hãy ấn định một khoảng thời gian ngắn và giữ nguyên cho mọi mẫu trong cùng một loạt.

Các mẫu có tỷ lệ sống thấp chịu một sai lệch thứ hai. Phương pháp chuẩn hóa cảnh báo rằng xanh methylen có thể đánh giá quá cao tỷ lệ sống thực khi tỷ lệ này dưới khoảng 80%, vì tế bào vẫn khử được thuốc nhuộm chưa chắc còn khả năng sinh sản. Tài liệu về sản xuất bia cũng mô tả tính thiếu tin cậy tương tự khi khả năng sống suy giảm đáng kể. Hãy coi xanh methylen là phương pháp ước tính gần đúng và nhanh, đồng thời xác nhận những quyết định quan trọng liên quan đến tỷ lệ sống thấp, chẳng hạn tái sử dụng mẻ nấm men, bằng phép đếm khuẩn lạc trên đĩa hoặc một phương pháp nhuộm bổ trợ.

Ảnh hưởng của nền mẫu là yếu tố thứ ba. Phương pháp OIV được thực hiện ở pH gần 4.6 và cảnh báo rằng mẫu pH thấp có khả năng đệm mạnh sẽ cản trở thuốc nhuộm hoạt động đúng, đồng thời khuyến cáo không dùng phép thử khi nồng độ đường trên 100 g/L, vì tế bào khi đó có màu xanh nhạt gây hiểu sai. Một thí nghiệm so sánh pH nhuộm ghi nhận độ nhạy thay đổi đáng kể trong khoảng được khảo sát, phù hợp với nghiên cứu về phương pháp xanh methylen phụ thuộc pH. Mảnh vụn là một nguồn sai lệch riêng: các hạt bắt màu trong dịch nghiền nguyên liệu nhiều tạp chất có thể trông giống tế bào chết và làm tăng khác biệt giữa những người thực hiện.

Sự khác biệt đó đã được định lượng, chứ không chỉ là nhận xét kinh nghiệm. Trong thử nghiệm kéo dài sáu tháng tại nhà máy bia được báo cáo trong nghiên cứu so sánh nấm men của FEMS, các phép đo lặp đôi bằng xanh methylen có độ lệch chuẩn trung bình 6.1%, so với 0.2% ở phép đo tế bào dòng chảy dùng oxonol; hai người thực hiện có thể cho kết quả chênh nhau tới 13 điểm phần trăm trên cùng một mẫu. Một nghiên cứu so sánh định lượng các phương pháp đánh giá khả năng sống năm 2023 cho thấy kính hiển vi huỳnh quang và phép đo tế bào dòng chảy có độ chụm cao hơn đáng kể, đồng thời cho thấy hiệu năng phụ thuộc vào loài và nền mẫu. Mô tả phương pháp kinh điển của Painting và Kirsop (PMID 24430080) vẫn là tài liệu tham chiếu nền tảng, còn bài tổng quan rộng hơn về các phép thử khả năng sống và hoạt lực của nấm men (PMID 25154541) xếp xanh methylen vào nhóm phép thử bổ trợ thay vì phép thử mang tính quyết định. Xanh trypan không mặc nhiên là lựa chọn nâng cấp ở đây: nó phản ánh sự mất tính toàn vẹn của màng, trong khi xanh methylen phản ánh cả sự hấp thu lẫn hoạt tính khử, nên tế bào chịu stress có thể được phân loại khác nhau khi dùng hai thuốc nhuộm này.

Thí nghiệm hô hấp: đo thời gian màu xanh biến mất

Phép thử thứ hai hoàn toàn không dùng kính hiển vi. Nấm men, glucose và xanh methylen loãng được cho vào một ống kín, rồi dùng đồng hồ đo thời gian để màu xanh biến mất. Khi chuyển hóa, tế bào tạo ra các đương lượng khử chuyển thuốc nhuộm xanh sang dạng không màu, trong khi oxy hòa tan oxy hóa nó trở lại. Khi tế bào làm giảm lượng oxy, quá trình khử chiếm ưu thế và ống nghiệm mất màu. Vì vậy, điểm kết thúc phản ánh sự cân bằng giữa hô hấp, nồng độ thuốc nhuộm và lượng oxy sẵn có; kết quả cần được báo cáo là thời gian khử hoặc mất màu xanh methylen, không phải tốc độ tiêu thụ oxy phân tử đo trực tiếp.

Dùng thuốc nhuộm loãng hơn nhiều so với phép đếm khả năng sống để thời gian đo nằm trong khoảng thuận tiện. Sổ tay thực hành bắt buộc A level của AQA chuẩn hóa việc này khá rõ: 1 g glucose trong 100 mL nước được làm ấm đến khoảng 30 C, thêm 5 g nấm men khô ngay trước khi dùng, và dung dịch thuốc nhuộm làm việc gần 0.001% được chuẩn bị bằng cách pha loãng 0.1 mL dung dịch gốc 1% đến 100 mL. Trộn 2 mL huyền phù nấm men–glucose với 2 mL dung dịch thuốc nhuộm làm việc, để cân bằng ở nhiệt độ thử nghiệm, lắc một lần trong 10 giây, bắt đầu bấm giờ và không lắc lại. Lắc đưa oxy trở lại và khiến ống nghiệm xanh trở lại; đây là sai lệch do thao tác lớn nhất. AQA lưu ý rằng hỗn hợp thông thường sẽ mất màu trong khoảng 5 phút ở 35 C, với thời gian trung bình trong các lần thử là 275 s ở 20 C, 128 s ở 35 C và 145 s ở 45 C. Đây là ví dụ từ một bố trí thí nghiệm, không phải mốc chuẩn phổ quát. Mối liên hệ định lượng giữa tốc độ khử và nấm men đang hoạt động chuyển hóa trong điều kiện được kiểm soát được củng cố bởi các nghiên cứu chuyên về quá trình khử, bao gồm công trình có mã PMID 25773544 và nghiên cứu cơ chế trên Yeast (2014).

Minh họa diễn biến theo thời gian (nội dung riêng của bài viết)

Bảng dưới đây là phần minh họa được tạo riêng cho bài viết, dùng bố trí theo AQA đã mô tả ở trên: 2 mL hỗn hợp nấm men–glucose cộng với 2 mL dung dịch thuốc nhuộm làm việc gần 0.001%, lắc một lần trong 10 giây, rồi ủ yên. Các mục là số liệu ví dụ theo định dạng mà một nhóm học sinh nên ghi lại, với chỉ số tốc độ được định nghĩa là 1 chia cho thời gian mất màu tính bằng giây. Hãy tiến hành với cùng các ống nghiệm này và thay những mục dưới đây bằng giá trị đo được.

Vẽ đồ thị chỉ số tốc độ theo nhiệt độ cho các ống A, B và C. Đường cong tăng rồi đi ngang hoặc giảm, là dạng diễn biến dự kiến của quá trình do enzyme chi phối, chứ không phải một đường thẳng. Các ống D, E và F không phải điểm dữ liệu trên đường cong đó. Chúng là các đối chứng giúp diễn giải đường cong.

Các đối chứng giúp mỗi phép thử có ý nghĩa

Mỗi lần thử hô hấp cần ba mẫu đi kèm. Nấm men đã đun sôi hoặc đã bị làm chết, cộng với glucose và thuốc nhuộm, phải giữ màu xanh, cho thấy sự khử nhanh phụ thuộc vào chuyển hóa của tế bào sống. Nấm men sống cộng với thuốc nhuộm nhưng không bổ sung glucose là đối chứng cơ chất; tuy nhiên, vẫn có thể mất màu chậm vì nấm men tiêu thụ nguồn dự trữ nội sinh. Glucose cộng với thuốc nhuộm nhưng không có nấm men là mẫu trắng hóa học, rất cần thiết vì glucose trong môi trường kiềm có thể khử xanh methylen ngay cả khi không có tế bào.

Phép đếm khả năng sống cần một kiểu kiểm soát khác: tính nhất quán của quy trình. Cùng dung dịch thuốc nhuộm gốc, cùng tỷ lệ trộn, cùng thời gian nhuộm, cùng vùng buồng đếm, cùng quy tắc đếm chồi và đường biên; thực hiện đếm mù khi có thể. Khi kết quả của hai người thực hiện chênh nhau mười điểm phần trăm, phiếu đếm thường cho thấy nguyên nhân: thời gian khác nhau, ngưỡng phân loại màu xanh khác nhau hoặc quy tắc đếm chồi khác nhau. Các kỹ thuật chuẩn bị và quan sát tế bào đã nhuộm có liên hệ với các phương pháp nhuộm đơn vi khuẩn, còn phần khảo sát rộng hơn về những cấu trúc mà thuốc nhuộm đánh dấu trong các loại mẫu nằm trong tập ảnh nhuộm hiển vi. Về cơ sở vật lý của việc đọc định lượng cường độ màu xanh, tài liệu tham chiếu hấp thụ có ghi rõ điều kiện giải thích vì sao mỗi hệ số phải đi kèm với các điều kiện dung môi, pH và nồng độ của nó.

Hãy chọn phép thử theo câu hỏi cần trả lời. Có bao nhiêu tế bào còn sống ngay lúc này là câu hỏi về đếm, được trả lời bằng kính hiển vi và phiếu đếm. Mẻ nuôi cấy này hô hấp tích cực đến mức nào là câu hỏi về động học, được trả lời bằng đồng hồ bấm giờ và các ống nghiệm được kiểm soát. Xanh methylen phục vụ cả hai mục đích, nhưng không bao giờ trong cùng một ống nghiệm ở cùng một thời điểm.