Xanh methylen để nhuộm DNA và RNA: ứng dụng trên gel và màng

Một sinh viên chạy gel agarose, nhuộm bằng xanh methylen rồi không thấy gì ở vị trí đáng lẽ phải có một băng rõ. Ở khu vực làm việc bên cạnh, một nghiên cứu viên sau tiến sĩ dùng cùng chai thuốc nhuộm xanh đó để nhuộm màng Northern và thu được các băng RNA ribosome sắc nét trong ba phút. Sinh viên kết luận rằng lần chạy gel đã thất bại. Nhưng gel không thất bại. Hai công việc có mục đích khác nhau, và cùng một thuốc nhuộm đáp ứng chúng với độ nhạy, mức nền và các quy tắc cho bước tiếp theo khác nhau.

Nhuộm DNA và nhuộm RNA bằng xanh methylen có chung cơ chế hóa học nhưng không cùng mục đích. Trong gel, thuốc nhuộm cho biết lượng axit nucleic nằm trong một nền xốp. Trên màng, thuốc nhuộm cho biết việc chuyển mẫu có thành công không và lượng mẫu nạp vào các giếng có đồng đều không. Khi hiểu rõ sự khác biệt này, các quy trình, giới hạn phát hiện và giới hạn tương thích sẽ trở nên dễ hiểu.

Câu trả lời ngắn gọn

Xanh methylen là thuốc nhuộm cation có cấu trúc phẳng, liên kết với axit nucleic theo cách không cộng hóa trị và thuận nghịch, nhờ sự kết hợp giữa lực hút tĩnh điện với phosphate, sự xen kẽ giữa các cặp base và sự liên kết với rãnh nhỏ. Tính thuận nghịch chính là điểm quan trọng. Có thể nhuộm các băng, quan sát dưới ánh sáng khả kiến, ghi lại hình ảnh, rồi tẩy màu hoặc làm sạch để tạo dòng, lai hoặc lai lại với đầu dò.

Để nhuộm DNA sợi đôi trong gel agarose bằng xanh methylen, công thức nhanh tiêu chuẩn là 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) trong nước, nhuộm khoảng 15 phút rồi tẩy màu bằng nước khoảng 15 phút, quan sát trên hộp chiếu sáng trắng. Đối với màng, công thức Northern blot kinh điển dùng thuốc nhuộm 0.02 đến 0.04 percent trong natri acetate ở pH khoảng 5.2, nhuộm vài phút sau khi chuyển mẫu và cố định, sau đó rửa bằng nước và tẩy màu hoàn toàn trước khi lai. Độ nhạy ở mức khiêm tốn: từ vài chục đến vài trăm nanograms trên mỗi băng gel trong điều kiện tốt; các hướng dẫn thận trọng đưa ra mức 0.5 đến 1 microgram. Mức này cao hơn nhiều bậc độ lớn so với ethidium bromide và các thuốc nhuộm SYBR. Trên màng, không có một giới hạn phát hiện bản phiên mã đơn lẻ nào hữu ích, vì thuốc nhuộm chủ yếu cho thấy RNA ribosome có hàm lượng cao và tổng lượng vật liệu đã nạp. Không thay thế thuốc nhuộm trong bất kỳ công thức nào bằng dung dịch thực phẩm bổ sung bán lẻ. Các phương pháp đã được thẩm định sử dụng thuốc nhuộm cấp phân tích, dung dịch đệm có thành phần xác định và thao tác không có RNase khi làm việc với RNA.

Cơ chế liên kết và những điểm dễ gây hiểu nhầm

Mô hình hữu ích gồm ba phần. Thứ nhất, hệ vòng mang điện tích dương bị hút bởi khung phosphate mang điện tích âm. Các nghiên cứu quang phổ cho thấy thành phần tĩnh điện này chiếm ưu thế ở nồng độ muối thấp, trong khi mô hình hóa và động lực học phân tử vẫn xác định sự xen kẽ và liên kết với rãnh nhỏ là những kiểu liên kết ổn định với DNA sợi đôi, như được tóm tắt trong một nghiên cứu quang phổ về liên kết giữa xanh methylen và DNA. Thứ hai, thuốc nhuộm có xu hướng ưu tiên GC ở một mức độ nhất định: mô hình hóa cho thấy ưu tiên các bước CpG và GpC, còn thí nghiệm ghi nhận sự liên kết ưu tiên với các phân tử sợi đôi giàu GC trong nghiên cứu về xu hướng xen kẽ của xanh methylen, nhưng các phân tử sợi đôi AT cũng liên kết với thuốc nhuộm. Việc nhuộm thông thường không đặc hiệu theo trình tự. Thứ ba, DNA sợi đơn và RNA liên kết chủ yếu thông qua tương tác tĩnh điện và tương tác xếp chồng với các base dễ tiếp cận cùng những vùng sợi đôi; vì vậy cường độ nhuộm thay đổi theo chiều dài, trình tự và cấu trúc bậc hai.

Từ đó có hai hệ quả. Vì liên kết không cộng hóa trị, thuốc nhuộm có thể bị rửa trôi. Các băng trên polyacrylamide phai nhanh nếu không được cố định chủ động; một biến thể cố định vĩnh viễn chuyên biệt đã được phát triển chính vì phương pháp nhuộm thông thường chỉ mang tính tạm thời, như Soto và Draper mô tả đối với gel PAGE. Vì thuốc nhuộm là chất nhạy quang, việc chiếu ánh sáng mạnh kéo dài lên DNA đã nhuộm trong môi trường có oxy có thể oxy hóa guanine và cuối cùng gây đứt một sợi, một cơ chế được trình bày chi tiết trong nghiên cứu về sự oxy hóa guanine do xanh methylen gây nhạy quang. Quan sát nhanh dưới ánh sáng trắng tránh được tổn thương do UV vốn đã được biết rõ trong các quy trình ethidium bromide truyền thống, và đó là một lợi thế thực sự khi thu hồi DNA cho các bước tiếp theo. Ánh sáng khả kiến nhẹ hơn, chứ không phải vô hại. Hãy giữ thời gian chiếu sáng ngắn khi DNA sẽ được dùng để tạo dòng. Để hiểu thêm về cơ chế quang hóa đằng sau lưu ý này, xem hai con đường trong quang hóa của xanh methylen. Để tìm hiểu cặp oxy hóa–khử và các trạng thái điện tích giải thích vì sao dạng oxy hóa liên kết còn dạng khử thì không, xem hóa học về cấu trúc và tính chất của xanh methylen.

Công việc thứ nhất: nhuộm trong gel

Nhuộm gel trả lời một câu hỏi: băng này có đủ axit nucleic để nhìn thấy bằng mắt hay không. DNA sợi đôi trong agarose là trường hợp được nghiên cứu rõ nhất. Phương pháp nhuộm gel bằng xanh methylen ban đầu của Flores và cộng sự đã thẩm định quy trình nhanh 0.02 percent trên agarose 1 percent và chứng minh khả năng thu hồi rồi tạo dòng thành công sau đó. Quy trình tương tự của nhà cung cấp được trình bày trên trang sản phẩm xanh methylen của IBI Scientific, trong đó công thức 0.04 percent cho màng và biến thể nhanh cho gel được liệt kê cạnh nhau.

Quy trình thực hành:

1. Chạy gel như bình thường. Nhuộm sau điện di, không nhuộm trong khi điện di, trừ khi khả năng chuyển mẫu hoặc độ phân giải đã được thẩm định cho phương pháp điều chỉnh.
2. Ngâm trong xanh methylen 0.02 percent w/v pha bằng nước cất, lắc nhẹ, khoảng 15 phút.
3. Tẩy màu qua vài lần thay nước, tổng cộng khoảng 15 phút, đến khi màu nền gel giảm và các băng hiện rõ.
4. Chụp ảnh ngay trên thiết bị chiếu sáng trắng.

Agarose và polyacrylamide có đặc tính khác nhau. Agarose giữ thuốc nhuộm trong nền gel, nên tẩy màu là bước chậm. Gel polyacrylamide mỏng nhuộm nhanh nhưng cũng mất màu nhanh; điều này thuận lợi cho việc cắt băng để thu hồi mẫu nhưng bất lợi cho việc lưu giữ hình ảnh. Có thể xác định vị trí các oligonucleotide tổng hợp trong polyacrylamide bằng cùng công thức 0.02 percent trong 20 đến 30 phút, với nhiều lần rửa bằng nước, theo các phương pháp PAGE đã được thiết lập theo dạng Current Protocols. Các biến thể rất loãng, khoảng 0.0002 percent trong TBE loãng, đã được báo cáo để chuẩn bị oligo trong vài giờ, nhưng cơ sở bằng chứng còn yếu hơn.

Sự khác biệt giữa DNA và RNA rất quan trọng. DNA sợi đôi cho liên kết có tổ chức mạnh nhất. RNA và DNA sợi đơn vẫn bắt màu, nhưng yếu hơn và khó dự đoán hơn. Đối với gel RNA agarose có formaldehyde, hầu hết phòng thí nghiệm bỏ qua việc nhuộm xanh trong gel và chuyển RNA lên màng trước, rồi nhuộm trên màng. Cách này thay tín hiệu yếu trong gel bằng tín hiệu sắc nét hơn trên màng, đồng thời tạo bản ghi về lượng mẫu nạp.

Công việc thứ hai: nhuộm trên màng

Nhuộm màng trả lời một câu hỏi khác: việc chuyển mẫu có thành công không, và các làn có thể so sánh với nhau không. Ứng dụng kinh điển là phương pháp nhuộm Northern blot thuận nghịch của Herrin và Schmidt, ban đầu dùng thuốc nhuộm 0.04 percent trong natri acetate 50 mM ở pH 5.0 trong 2 đến 3 phút, sau đó rửa bằng nước; thuốc nhuộm có thể được loại bỏ bằng SDS loãng trong SSPE trước khi lai.

Biến thể hiện đại được sử dụng rộng rãi gồm các bước sau:

1. Chuyển RNA hoặc DNA đã biến tính lên nylon hoặc nitrocellulose, rồi cố định bằng liên kết chéo UV hoặc sấy để mẫu không bị mất trong quá trình nhuộm.
2. Bước tùy chọn nhưng thường dùng: làm ướt màng trong axit acetic 5 percent khoảng 15 phút.
3. Nhuộm trong 5 đến 10 phút bằng xanh methylen 0.02 đến 0.04 percent trong natri acetate 0.3 đến 0.5 M ở pH khoảng 5.2.
4. Rửa và tẩy màu bằng nước trong 5 đến 15 phút, ghi lại hình ảnh, rồi loại bỏ thuốc nhuộm còn sót trước khi lai.

Nylon tích điện dương được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật Northern. Nitrocellulose cũng phù hợp với cùng quy trình dùng axit acetic kết hợp acetate. Hình ảnh được dùng để xác nhận việc chuyển mẫu, so sánh các băng 28S và 18S (hoặc 23S và 16S đối với RNA vi khuẩn), đánh dấu thang và mẫu chuẩn, đồng thời lưu bản ghi để chuẩn hóa sơ bộ theo tổng lượng RNA. Các phương pháp Northern đã công bố định lượng các băng RNA ribosome đã nhuộm để kiểm tra lượng mẫu nạp, trong đó có nghiên cứu khoa học sữa sử dụng các băng RNA ribosome nhuộm xanh methylen để chuẩn hóa. Có thể quan sát màng Southern theo cách tương tự, nhưng thuốc nhuộm này được sử dụng phổ biến hơn nhiều để kiểm tra lượng mẫu nạp và việc chuyển mẫu trong Northern. DNA trong Southern được biến tính trước khi chuyển, nên các số liệu độ nhạy trên gel không áp dụng trực tiếp.

Giới hạn phát hiện và nền: điểm yếu của thuốc nhuộm xanh

Bảng so sánh dưới đây được chủ ý trình bày ở mức gần đúng. Hiệu năng của thuốc nhuộm phụ thuộc vào nồng độ gel, độ rộng băng, hệ quang học và cách kiểm soát quá trình tẩy màu. Hãy xem mỗi con số là một bậc độ lớn, không phải thông số kỹ thuật.

Việc kiểm soát nền quyết định tín hiệu khiêm tốn này có sử dụng được hay không. Thuốc nhuộm tự do có màu rất đậm, nên độ tương phản được tạo ra bằng cách loại bỏ thuốc nhuộm chưa liên kết mà không làm mất thuốc nhuộm đã liên kết. Tăng nồng độ thuốc nhuộm hiếm khi làm tăng độ nhạy. Chủ yếu nó làm kéo dài thời gian tẩy màu. Hãy chạy một dãy pha loãng trên đúng gel, màng và máy ảnh sẽ sử dụng, và chỉ dùng khoảng mà mật độ tích phân còn tỷ lệ với lượng đầu vào. Xanh methylen hỗ trợ chuẩn hóa lượng mẫu nạp theo cách bán định lượng. Đây không phải phép định lượng có dải động rộng vì sức chứa của màng, hiệu suất chuyển mẫu, mức bão hòa và quá trình tẩy màu thay đổi giữa các làn.

Giới hạn tương thích: những bước vẫn thực hiện được sau nhuộm

Khả năng tạo dòng sau khi nhuộm xanh đã được chứng minh. Flores và cộng sự cắt các băng agarose đã nhuộm, thu hồi DNA, rồi nối và biến nạp; họ báo cáo kết quả tạo dòng tốt hơn so với sau khi nhuộm ethidium bromide và chiếu UV. Nguyên nhân có thể là tổn thương do ánh sáng ít hơn, chứ không phải lợi ích từ chính thuốc nhuộm. Hãy giữ thời gian chiếu ánh sáng trắng ngắn và làm sạch DNA thu hồi bằng quy trình tách chiết DNA từ gel thông thường.

Bằng chứng cho PCR và giải trình tự còn hạn chế hơn. Thuốc nhuộm còn sót liên kết với axit nucleic, nên cần tẩy màu và làm sạch trước các bước dùng enzyme. DNA được tinh sạch đúng cách từ gel nhuộm xanh được kỳ vọng là sử dụng được, nhưng mức dung nạp trực tiếp đối với thuốc nhuộm mang theo chưa được định lượng rõ cho các polymerase và hệ hóa chất giải trình tự khác nhau. Không nên mặc nhiên cho rằng chúng đều dung nạp được.

Lai trên màng blot tương thích khi tuân thủ nghiêm ngặt thứ tự: chuyển mẫu, cố định, nhuộm, ghi lại hình ảnh, tẩy màu, lai. Đó là trình tự do Herrin và Schmidt thiết kế. Nhuộm trước khi chuyển mẫu, hoặc bỏ qua bước tẩy màu, là một phương pháp khác và cần được thẩm định riêng. Sau khi loại bỏ thuốc nhuộm, có thể tiến hành loại bỏ đầu dò và lai lại theo quy trình tiêu chuẩn như bình thường. Để tìm hiểu việc nhuộm ở cấp độ tế bào bằng cùng họ thuốc nhuộm và vì sao nguyên tắc áp dụng cho tiêu bản đã cố định không áp dụng trực tiếp cho phương pháp trên tế bào sống, xem bộ hướng dẫn nhuộm trong hiển vi.

Có thể cắt băng để thu hồi mẫu từ agarose và từ gel PAGE chứa oligo được xác định vị trí bằng thuốc nhuộm xanh, miễn là không dùng biến thể cố định vĩnh viễn. Với một chất liên kết thuận nghịch, rửa giải bằng điện sau khi tẩy màu là khả thi về mặt hóa học, nhưng dữ liệu hiệu suất thu hồi có kiểm soát dành riêng cho xanh methylen còn ít. Hãy khử muối hoặc kết tủa sau khi rửa giải.

Những sự cố thường lặp lại

Các băng gel mờ thường cho thấy khối lượng mẫu quá thấp đối với thuốc nhuộm đo màu, đặc biệt với đích sợi đơn ngắn hoặc RNA. Hãy nạp nhiều mẫu hơn, dùng thuốc nhuộm mới, kéo dài thời gian nhuộm trước khi tăng nồng độ và dừng tẩy màu sớm hơn. Gel xanh đậm đồng nhất, không có độ tương phản, thường do nhuộm quá mức hoặc thay nước quá ít lần. Các băng PAGE phai màu là diễn biến hóa học dự kiến, không phải nhuộm thất bại. Hãy chụp ảnh nhanh. Nền màng không đồng đều có thể do nếp gấp, bọt khí, dấu vân tay, lắc không đều hoặc chuyển mẫu không đồng nhất. Đừng diễn giải hiện tượng đó thành lượng mẫu nạp không đều nếu không có đối chứng lai. Mẫu băng RNA ribosome yếu và bị nhòe có thể cho thấy sự phân hủy, nhưng cũng có thể do chuyển mẫu chưa hoàn toàn, tổng lượng RNA quá thấp (các làn thông thường chứa từ vài đến vài chục micrograms) hoặc tẩy màu quá mức. Thuốc nhuộm phản ánh RNA ribosome có hàm lượng cao. Nó không phản ánh một bản phiên mã cụ thể. Đó là nhiệm vụ của đầu dò.

An toàn và thao tác: không khẳng định quá mức

Xanh methylen dễ thao tác hơn ethidium bromide, nhưng không phải vô hại. Một phiếu dữ liệu an toàn hiện hành của MilliporeSigma phân loại thuốc nhuộm này vào Nhóm 4 về độc tính cấp tính qua đường miệng, có hại nếu nuốt phải, và yêu cầu xử lý qua hệ thống chất thải được phê duyệt theo SDS xanh methylen của Sigma-Aldrich. Ethidium bromide có các cảnh báo mạnh hơn về độc tính di truyền, bao gồm nghi ngờ tác động lên tế bào mầm trong SDS ethidium bromide của Sigma-Aldrich; gel và dung dịch chứa chất này thường được phân loại riêng là chất thải hóa học nguy hại, như nêu trong hướng dẫn thuốc nhuộm axit nucleic của Thermo Fisher. Tuân thủ SDS và quy định của cơ sở đối với cả hai chất. Bảo quản thuốc nhuộm dạng khô trong bao bì đậy kín, khô ráo; chỉ tái sử dụng dung dịch nhuộm làm việc khi quy trình cho phép; bảo quản màng đã nhuộm ở trạng thái khô giữa các tờ giấy lọc; và chụp ảnh gel trước khi các băng khuếch tán mất.

Hãy nhớ nguyên tắc khi làm việc tại bàn thí nghiệm. Gel kiểm tra khả năng nhìn thấy mẫu ở lượng nạp cao dưới ánh sáng trắng. Màng kiểm tra việc chuyển mẫu và lượng mẫu nạp trước khi đầu dò thực hiện phần phát hiện có độ nhạy cao. Một thuốc nhuộm phục vụ cả hai mục đích, với độ nhạy khiêm tốn, liên kết thuận nghịch và thứ tự thao tác phải được tuân thủ nghiêm ngặt.