Xanh methylen và truyền tín hiệu viêm: inflammasome, IL-6 và STAT3

Giả sử ba phòng thí nghiệm báo cáo rằng cùng một hợp chất màu xanh có tác dụng chống viêm. Một nơi ghi nhận đại thực bào tạo ra ít IL-1beta hơn. Một nơi ghi nhận ít enzyme iNOS hơn trong cùng loại tế bào đó. Một nơi ghi nhận ít IL-6 hơn trong máu và hoạt tính STAT3 thấp hơn trong não. Rất dễ gộp cả ba thành một nhận định. Nhưng việc gộp như vậy che khuất phát hiện thực sự.

Mỗi kết quả thuộc về một cơ chế truyền tín hiệu khác nhau, với tác nhân kích hoạt, bước lắp ráp và chỉ số đo riêng. Xanh methylen tác động vào mỗi cơ chế ở một điểm khác nhau. Liệu những điều này có cải thiện kết quả sức khỏe hay không là một câu hỏi riêng, được đề cập trong bài tổng quan về xanh methylen và viêm của chúng tôi. Trang này chỉ tập trung vào các con đường truyền tín hiệu.

Con đường 1: lắp ráp inflammasome và caspase-1

Inflammasome là một bộ khung protein được hình thành khi cần bên trong tế bào dòng tủy. Các thành phần gồm một protein cảm biến, một protein tiếp hợp gọi là ASC và một enzyme thực thi gọi là caspase-1. Sau khi được lắp ráp, caspase-1 cắt pro-IL-1beta và pro-IL-18 thành các dạng được tiết ra, đồng thời có thể kích hoạt pyroptosis, một dạng chết tế bào gây viêm. Protein cảm biến quyết định loại inflammasome: NLRP3 đáp ứng với tinh thể và các tác nhân tạo lỗ màng như nigericin và ATP, NLRC4 đáp ứng với flagellin của vi khuẩn, AIM2 đáp ứng với DNA sợi đôi trong bào tương, còn con đường không kinh điển đáp ứng với lipopolysaccharide nội bào.

Quá trình hoạt hóa cần hai tín hiệu. Tín hiệu thứ nhất là mồi: một phối tử của thụ thể giống Toll thúc đẩy quá trình phiên mã NLRP3 và pro-IL-1beta phụ thuộc NF-kB để tạo sẵn các thành phần. Tín hiệu thứ hai là lắp ráp: một tác nhân kích hoạt thứ hai khiến ASC tạo oligomer thành các đốm, caspase-1 được cắt thành mảnh p20 và IL-1beta p17 trưởng thành được giải phóng. Các dạng oxy phản ứng của ty thể và sự thu nhận tinh thể được biết là những yếu tố góp phần vào tín hiệu thứ hai của NLRP3.

Nghiên cứu năm 2017 trên đại thực bào về sự ức chế nhiều loại inflammasome đã kiểm tra xanh methylen ở cả hai tín hiệu. Trong đại thực bào tủy xương chuột đã được mồi bằng lipopolysaccharide, nigericin, ATP và tinh thể urat monosodium đều gây giải phóng IL-1beta và caspase-1, đồng thời hình thành các đốm ASC. Xanh methylen ở nồng độ 20 đến 200 micromolar làm giảm cả ba theo mức độ phụ thuộc liều mà không làm chết tế bào. Flagellin và Salmonella đối với NLRC4, DNA sợi đôi và Listeria đối với AIM2, cùng lipopolysaccharide được chuyển vào tế bào hoặc E. coli sống đối với con đường không kinh điển đều cho thấy cùng một kiểu kết quả. Hợp chất dùng đơn độc không kích hoạt sự giải phóng, và các đĩa đối chứng không cho thấy tác dụng kháng khuẩn, nên kết quả này thuộc về đáp ứng của vật chủ.

Ở phía thượng nguồn, ba tác động được đo lường. Superoxide ty thể do rotenone gây ra giảm khi có xanh methylen, và sự giải phóng IL-1beta do rotenone thúc đẩy cũng giảm theo. Sự thu nhận các hạt huỳnh quang giảm, phù hợp với việc giảm thực bào trước bước cảm nhận tinh thể. Một hệ báo cáo do vùng khởi động NLRP3 có hai vị trí NF-kB điều khiển cho thấy hoạt tính thấp hơn khi có xanh methylen, trong khi vùng khởi động rút ngắn không có các vị trí đó không đáp ứng. Trong ống nghiệm không có tế bào, xanh methylen cũng trực tiếp làm giảm hoạt tính caspase-1 người tái tổ hợp. Chỉ thêm hợp chất ở bước mồi hoặc chỉ ở bước hoạt hóa vẫn làm giảm sự giải phóng IL-1beta, IL-18 và caspase-1, cho thấy cả hai bước đều chịu tác động.

Các thử nghiệm trên chuột phù hợp với tính chọn lọc này. Một liều lipopolysaccharide gây chết khiến chuột đối chứng chết trong vòng vài giờ, trong khi xanh methylen cải thiện khả năng sống sót; IL-1beta trong dịch phúc mạc giảm nhưng IL-6 trong cùng dịch đó không giảm. Trong mô hình viêm phúc mạc do Listeria, IL-1beta trong dịch phúc mạc giảm trong khi tổng số tế bào không thay đổi. Bạch cầu đơn nhân THP-1 của người có đáp ứng tương tự đại thực bào chuột ở cả bốn loại inflammasome. Kết quả về inflammasome giải thích sự trưởng thành của IL-1beta và IL-18, chứ không phải mọi cytokine. Đây cũng là lý do hình dạng tế bào miễn dịch trong não ở các thí nghiệm về tế bào vi thần kinh đệm và tế bào hình sao trả lời một câu hỏi khác với sự lắp ráp bộ khung.

Con đường 2: phiên mã iNOS thông qua sự gắn kết của NF-kB và STAT1

Enzyme tổng hợp nitric oxide cảm ứng, hay iNOS, gần như không hiện diện ở trạng thái nghỉ và được phiên mã khi cần. Lipopolysaccharide thúc đẩy quá trình này chủ yếu thông qua sự phân hủy IkB-alpha, sau đó là phosphoryl hóa NF-kB và đưa NF-kB vào nhân. Interferon-gamma thúc đẩy quá trình này chủ yếu thông qua sự phosphoryl hóa STAT1 bởi Janus kinase, sau đó STAT1 đi vào nhân. Tiếp theo, mỗi yếu tố gắn vào vị trí tương ứng trên vùng khởi động iNOS. Hoạt tính enzyme và sự cảm ứng biểu hiện gen là hai điểm kiểm soát riêng biệt, và một thuốc có thể tác động tại một hoặc cả hai điểm.

Nghiên cứu năm 2015 về cảm ứng iNOS ở đại thực bào và chuột bị nhiễm độc nội độc tố xác định tác động ở mức RNA thông tin. Trong tế bào RAW 264.7 và đại thực bào nguyên phát của chuột, xanh methylen ở nồng độ 1 micromolar được dùng 30 phút trước lipopolysaccharide, interferon-gamma hoặc cả hai làm giảm protein và mRNA iNOS trong khoảng 8 đến 24 giờ, với lượng nitrit trong môi trường nuôi cấy thấp hơn và không làm giảm khả năng sống của tế bào. Ở chuột được dùng lipopolysaccharide 25 mg per kg, một liều duy nhất 5 mg per kg dùng trước đó một giờ làm giảm protein và mRNA iNOS trong phổi, gan và tim.

Chi tiết khác biệt nằm ở những gì không thay đổi. Sự phân hủy IkB-alpha, phosphoryl hóa NF-kB, phosphoryl hóa STAT1 và sự tích lũy trong nhân của cả hai yếu tố đều vẫn diễn ra bình thường. Sự gián đoạn xảy ra ở bước tiếp theo: dịch chiết nhân cho thấy NF-kB gắn ít hơn vào trình tự DNA tương ứng sau khi tiếp xúc với lipopolysaccharide và STAT1 gắn ít hơn sau khi tiếp xúc với interferon-gamma. Phép kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất xác nhận mức gắn kết của cả hai yếu tố tại vùng khởi động iNOS bên trong tế bào đều giảm. Yếu tố hoại tử khối u alpha, có vùng khởi động cũng sử dụng NF-kB, cũng giảm. Các yếu tố đã được hoạt hóa và đã đến nhân, nhưng gắn kết kém với DNA đích.

Hãy lưu ý sự khác biệt với con đường 1. Cơ chế này liên quan đến sự gắn kết của yếu tố với DNA, sử dụng STAT1 chứ không phải STAT3, và đo mRNA, protein cùng nitrit thay vì các đốm ASC và mảnh caspase-1. Bản đồ các đích tác động của xanh methylen trong các mô hình tế bào của chúng tôi tách riêng cấp độ phiên mã này khỏi các phép đo trực tiếp về enzyme và ty thể.

Con đường 3: IL-6 huyết thanh và hoạt hóa STAT3 trong mô

IL-6 truyền tín hiệu qua họ thụ thể gp130 vào chuỗi truyền tín hiệu từ Janus kinase đến STAT3. STAT3 được phosphoryl hóa tạo dimer, đi vào nhân và thúc đẩy các chương trình gây viêm, trong khi bản thân IL-6 là một đích của NF-kB. Vì vậy, hai thành phần tạo thành một vòng phản hồi thường được gọi là trục IL-6 đến STAT3. Các chỉ số đo tiêu chuẩn là IL-6 huyết thanh ở phía thượng nguồn, tỷ lệ STAT3 được phosphoryl hóa trên tổng STAT3, và các enzyme thực thi như iNOS và COX2 ở phía hạ nguồn.

Nghiên cứu năm 2023 trên chuột về IL-6 và STAT3 sau khi dùng lipopolysaccharide đo lường trục này ở nhiều khoang sinh học. Chuột đực C57BL/6 được dùng lipopolysaccharide 1 mg per kg mỗi ngày trong ba ngày, cùng với xanh methylen 5 hoặc 10 mg per kg vào 30 phút sau mỗi liều. Vào ngày thứ ba, IL-6 huyết thanh ở cả hai nhóm dùng xanh methylen đều thấp hơn so với nhóm chỉ dùng lipopolysaccharide, trong khi phần lớn cytokine khác trong bộ xét nghiệm không thay đổi theo can thiệp. Tỷ lệ STAT3 được phosphoryl hóa trên tổng STAT3 thấp hơn ở vỏ não, hồi hải mã và da tai, đi kèm mức nhuộm Iba-1 của tế bào vi thần kinh đệm thấp hơn, iNOS và COX2 thấp hơn, cùng mức sụt cân được giảm nhẹ một phần.

Có hai điểm cần thận trọng ở đây. IL-6 huyết thanh thấp hơn cùng với mức phosphoryl hóa STAT3 trong mô thấp hơn phù hợp với sự điều biến trục này, nhưng không xác định riêng được nút tác động chính, vì giảm cytokine thượng nguồn, giảm truyền tín hiệu qua thụ thể hoặc thay đổi hoạt tính phosphatase đều có thể tạo ra cùng một tỷ lệ. Ngoài ra, cân nặng trong ba ngày thử thách cấp tính là một chỉ số ở cấp độ toàn bộ động vật, không phải điểm số triệu chứng hay mức độ thuyên giảm. Chỉ số này bổ sung bối cảnh ngoài kết quả trên màng blot mà không biến một kết quả về truyền tín hiệu thành nhận định về điều trị. Các quá trình hóa học riêng biệt trong điều hòa oxy hóa khử ở ty thể diễn ra song song với cơ chế cytokine này và không nên gộp chung với nó.

So sánh các con đường: điểm can thiệp và chỉ số đo

Bảng này ngăn ba cách suy diễn không hợp lệ. Kết quả về đốm ASC không chứng minh kết quả về STAT3. Kết quả về STAT1 gắn với vùng khởi động iNOS không chứng minh kết quả về STAT3, dù cả hai protein đều thuộc họ STAT. Kết quả về IL-6 huyết thanh không chứng minh sự lắp ráp inflammasome giảm: trong thí nghiệm ở phúc mạc, IL-1beta giảm trong khi IL-6 không giảm. Mỗi hàng cần tác nhân kích hoạt và chỉ số đo riêng. Đó là lý do khi đọc các nghiên cứu xanh methylen trên tế bào, động vật và trong lâm sàng, cần đối chiếu mỗi nhận định với đúng cấp độ đã được đo lường.

Không kết quả nào trong số này xác lập liều dùng, tính an toàn hay lợi ích ở người. Các mô hình lipopolysaccharide là những tác nhân kích hoạt được kiểm soát để kiểm tra một cơ chế, không phải bản sao của bệnh mạn tính. Việc dùng hợp chất cùng với tác nhân kích hoạt kiểm tra khả năng ngăn ngừa một thay đổi được gây ra, chứ không phải đảo ngược bệnh đã hình thành. Hãy tách riêng phần giải thích cơ chế này khỏi kết quả ở bệnh nhân, và đánh giá mọi nhận định về sức khỏe dựa trên nghiên cứu ở bệnh nhân làm cơ sở cho nhận định đó.