Thử nghiệm khử xanh methylene trong dịch dạ cỏ

Một nữ sinh viên mới tốt nghiệp gọi điện từ trang trại, trên tay cầm một ống nghiệm màu xanh. Cô đã thêm xanh methylene vào dịch dạ cỏ mười phút trước nhưng màu xanh vẫn còn. Cô hỏi liệu có nên cho bò dùng thêm chất nhuộm hay không.

Câu hỏi đó cho thấy một cách hiểu sai. Trong thử nghiệm khử xanh methylene đối với dịch dạ cỏ, chất nhuộm được cho vào ống nghiệm, tuyệt đối không đưa vào con vật. Toàn bộ phép thử diễn ra trong ống nghiệm. Đo thời gian màu xanh biến mất cho biết phần nào về vi sinh vật trong mẫu đó, chứ không cho biết con vật cần điều trị gì.

Sự nhầm lẫn này có thể hiểu được vì xanh methylene xuất hiện trong ba bối cảnh thú y riêng biệt. Bài viết này phân biệt rõ các bối cảnh đó và hướng dẫn cách đọc thời gian khử cùng với pH, động vật nguyên sinh, chất lượng lấy mẫu và dấu hiệu lâm sàng.

Thử nghiệm thực sự đo điều gì

Xanh methylene có màu xanh khi bị oxy hóa và gần như không màu khi bị khử. Dịch dạ cỏ tươi từ một con vật khỏe mạnh có tính khử mạnh vì vi khuẩn kỵ khí đang tích cực lên men thức ăn. Khi trộn một lượng nhỏ chất nhuộm vào dịch như vậy, quá trình chuyển hóa của vi khuẩn làm mất màu trong vòng vài phút.

Vì vậy, nguyên lý vận hành rất đơn giản: hệ vi sinh vật kỵ khí hoạt động mạnh làm mất màu xanh nhanh, còn hệ vi sinh vật ít hoạt động hoặc bị tổn hại làm mất màu chậm. Thời gian ngắn cho thấy khả năng khử cao hơn trong mẫu đó. Thời gian kéo dài gợi ý hoạt động vi sinh vật bị suy giảm, với điều kiện mẫu được thu thập và xử lý tốt.

Thử nghiệm này không đo trực tiếp thế oxy hóa khử của dạ cỏ. Một nghiên cứu phương pháp trên bò đã so sánh thử nghiệm khử với phép đo trực tiếp bằng millivolt và không tìm thấy tương quan tuyến tính giữa thời gian khử và thế oxy hóa khử đo được. Nghiên cứu kết luận rằng không nên coi hai kết quả này là những phép đo có thể thay thế nhau của cùng một biến số. Bản tóm tắt toàn bộ phép so sánh có trên PubMed. Hãy xem thử nghiệm khử là một phép đánh giá chức năng của quần thể vi sinh vật, không phải một điện cực giá rẻ.

Mô tả của Merck/MSD về chứng khó tiêu đơn thuần ở động vật nhai lại đặt thời gian khử kéo dài trong cùng một nhóm biểu hiện với pH dạ cỏ bất thường và số lượng động vật nguyên sinh giảm. Không có giá trị riêng lẻ nào xác lập chẩn đoán. Chính sự kết hợp các biểu hiện mới làm được điều đó.

Một quy trình tiêu chuẩn tại chỗ

Các quy trình có khác biệt nhỏ giữa các trường, vì vậy hãy ghi lại chính xác thể tích và nhiệt độ sử dụng, đồng thời chỉ so sánh kết quả trong cùng một quy trình. Một cách thực hiện được giảng dạy rộng rãi là:

1. Thu ít nhất 10 đến 20 mL dịch dạ cỏ tươi, hạn chế tối đa nước bọt, tiếp xúc với không khí và tình trạng nguội đi. Thử nghiệm ngay.
2. Chuẩn bị xanh methylene 0.03 phần trăm, tương đương 0.3 mg trên mỗi mL.
3. Thêm chất nhuộm với lượng bằng 5 phần trăm thể tích dịch. Tức là 1.0 mL chất nhuộm vào 20 mL dịch, hoặc 0.5 mL chất nhuộm vào 10 mL dịch. Cả hai đều cho tỷ lệ dịch so với chất nhuộm là 20 trên 1.
4. Giữ một ống thứ hai chứa dịch chưa thêm chất nhuộm từ cùng mẫu làm đối chứng màu.
5. Trộn nhẹ, bắt đầu tính giờ ngay và giữ ống nghiệm gần nhiệt độ cơ thể, khoảng 37 đến 39 độ Celsius tùy theo quy trình tại cơ sở.
6. Ghi lại thời gian cho đến khi màu của ống thử giống với ống đối chứng. Một vòng xanh mỏng ở bề mặt tiếp xúc với không khí có thể còn lại vì oxy tái oxy hóa chất nhuộm tại đó. Không chờ vòng này biến mất.

Hóa học oxy hóa khử của xanh methylene giải thích vì sao oxy quan trọng trong trường hợp này. Lắc mạnh, để ống nghiệm mở rộng miệng hoặc trì hoãn lâu sẽ khiến oxy đi vào và giữ màu xanh lâu hơn so với điều kiện trong chính dạ cỏ. Các chi tiết về kỹ thuật lấy mẫu dịch dạ cỏ hạn chế tạp nhiễm cũng quan trọng vì lý do tương tự. Nước bọt làm loãng mẫu và tăng pH, nên khi dùng ống thông dạ dày, nhiều bác sĩ thú y bỏ phần dịch đầu tiên nếu thể tích cho phép.

Những quan sát khác nhau đo điều gì

Thời gian khử chỉ trả lời một câu hỏi. Bảng đánh giá dạ cỏ dưới đây cho thấy mỗi quan sát tại chỗ đóng góp thông tin gì. Hãy sử dụng toàn bộ hàng, không chỉ một ô.

Điểm cốt lõi nằm ở bảng này. Thời gian khử kéo dài cùng với động vật nguyên sinh vận động chậm, pH bất thường và co bóp yếu gợi ý hoạt động vi sinh vật thực sự bị suy giảm. Thời gian kéo dài đơn độc ở một con vật tỉnh táo, đang nhai lại và có động vật nguyên sinh hoạt động mạnh lại gợi ý vấn đề ở mẫu, không phải ở dạ cỏ. Hãy lấy lại mẫu trước khi hành động.

Đọc thời gian cùng với pH và tiền sử

Khẩu phần quyết định mức nền. Khẩu phần giàu thức ăn tinh lên men nhanh và có thể làm mất màu chất nhuộm trong khoảng một phút, trong khi khẩu phần cỏ khô có thể cần vài phút, ngay cả ở con vật khỏe mạnh. Vì vậy, thời gian ngắn tự nó không chứng minh sức khỏe tốt hơn. Nó chỉ chứng minh rằng nhiều cơ chất có thể lên men hơn đã gặp các vi sinh vật đang hoạt động.

Tình trạng ăn quá nhiều ngũ cốc ở mức nghiêm trọng phá vỡ xu hướng đơn giản đó. Ban đầu, quá trình lên men carbohydrate có thể diễn ra mạnh, sau đó tổn thương do axit ức chế hệ vi sinh vật bình thường và động vật nguyên sinh, khiến thời gian khử kéo dài. Vì vậy, một quy tắc thường được giảng dạy nêu rằng thử nghiệm không có giá trị khi pH dạ cỏ thấp hơn khoảng 5.5. Khi đó, hệ vi sinh vật đang được kiểm tra đã thay đổi.

Hướng dẫn thực tế để đọc các tổ hợp kết quả:

• pH bình thường cùng với quá trình khử hoàn tất trong khoảng 6 phút gợi ý hệ vi sinh vật đang hoạt động tốt về mặt chức năng.
• pH bình thường cùng với thời gian khử kéo dài rõ rệt gợi ý tình trạng ít hoạt động do bỏ ăn, tác dụng của thuốc kháng vi sinh vật hoặc mẫu bị ảnh hưởng.
• pH cao cùng với thời gian khử kéo dài thường xuất hiện sau thời gian bỏ ăn kéo dài, khi có ít cơ chất, nhưng cần cân nhắc khả năng nhiễm nước bọt khi lấy mẫu bằng ống thông.
• pH thấp cùng với hoạt động của động vật nguyên sinh giảm làm dấy lên lo ngại về mất cân bằng hệ vi sinh vật liên quan đến carbohydrate. Hướng dẫn diễn giải pH dạ cỏ hữu ích trong trường hợp này. Giá trị dưới 5.5 đi kèm tình trạng suy giảm toàn thân gợi ý ăn quá nhiều ngũ cốc và nhiễm toan nặng hơn là chứng khó tiêu đơn thuần.

Luôn ghi lại việc dùng tetracycline đường uống gần đây, chất ionophore trong thức ăn, việc dùng thuốc kháng vi sinh vật toàn thân kéo dài, thay đổi khẩu phần đột ngột, thời gian bỏ ăn và lượng nước uống. Sổ tay MSD đặc biệt cảnh báo rằng tetracycline đường uống có thể làm suy giảm đáng kể hệ vi sinh vật dạ cỏ. Chất ionophore được dùng nhằm làm thay đổi quần thể vi khuẩn. Không có những thông tin tiền sử đó thì không thể diễn giải thời gian kéo dài.

Chất lượng lấy mẫu cần được coi trọng ngang nhau. Nghiên cứu có đối chứng cho thấy mẫu lấy bằng ống thông dạ dày có pH cao hơn và hàm lượng axit béo bay hơi thấp hơn so với mẫu lấy qua ống thông dạ cỏ trên cùng con vật, chủ yếu do nước bọt. Ở mốc 60 phút sau khi lấy mẫu, thời gian khử tăng đáng kể với mọi thể tích được thử, trong đó các mẫu nhỏ bị ảnh hưởng nhiều nhất. Thu ít nhất 10 mL, kiểm tra trong vòng 30 phút, thực hiện thử nghiệm khử sớm, giữ mẫu ấm và hạn chế tiếp xúc với không khí.

Ba cách sử dụng không được nhầm lẫn

Cùng một chất nhuộm, ba hệ thống khác nhau.

Thứ nhất là phép thử dịch dạ cỏ được mô tả ở đây. Mẫu xét nghiệm là dịch dạ cỏ đã thu thập. Chất nhuộm được thêm trong ống nghiệm ở nồng độ 0.03 phần trăm. Điểm kết thúc là thời gian đến khi mất màu. Mục đích là đánh giá hoạt động khử của vi sinh vật.

Thứ hai là dùng xanh methylene cho động vật nhai lại còn sống. Ví dụ đã được xác lập là điều trị đường tĩnh mạch cho tình trạng ngộ độc nitrate hoặc nitrite kèm methemoglobin huyết, trong đó thuốc khôi phục hemoglobin có chức năng. Các quy định về liều, dạng bào chế, tồn dư và thời gian ngừng thuốc đều phải được áp dụng. Quyết định đó không liên quan gì đến việc tính thời gian trong một ống nghiệm. Nếu chất nhuộm được dùng làm chất đánh dấu trong cơ thể ở một quy trình cụ thể, nguyên lý là theo dõi chất nhuộm đi đến đâu, không phải vi sinh vật dạ cỏ khử nó nhanh đến mức nào.

Thứ ba là thử nghiệm khử trên sữa. Mẫu xét nghiệm là sữa. Chất nhuộm được thêm vào mẫu sữa. Màu xanh mất nhanh thường cho thấy hoạt động vi sinh vật cao hơn và khả năng bảo quản kém hơn, còn quá trình khử chậm cho thấy chất lượng tốt hơn. Thử nghiệm này thuộc vi sinh vật học thực phẩm và kiểm tra chất lượng sữa, không thuộc chuyên môn về dạ cỏ, và không phải phép đếm vi khuẩn.

Gọi tên rõ ràng giúp tránh sai sót: thời gian khử trong dịch dạ cỏ, điều trị toàn thân hoặc sử dụng xanh methylene làm chất đánh dấu, và thử nghiệm khử trên sữa. Quy tắc an toàn có thể gói gọn trong một câu. Chất nhuộm dùng cho phép thử dạ cỏ phải ở trong ống nghiệm phòng thí nghiệm và ống đó phải được loại bỏ. Tuyệt đối không cho con vật dùng chất nhuộm để thực hiện thử nghiệm.

Một quy tắc ngắn gọn cho cuộc gọi từ trang trại

Chuẩn hóa chất nhuộm ở nồng độ 0.03 phần trăm và tỷ lệ 1 phần chất nhuộm với 20 phần dịch, kiểm tra dịch tươi ở gần nhiệt độ cơ thể bằng cách đối chiếu với mẫu đối chứng chưa thêm chất nhuộm, và diễn giải số phút cùng với pH, khả năng vận động của động vật nguyên sinh, chất lượng lấy mẫu, khẩu phần, thuốc, co bóp, sự thèm ăn, phân và tình trạng nước của cơ thể. Một con số đơn lẻ không bao giờ chẩn đoán được chứng khó tiêu. Một tổ hợp biểu hiện nhất quán mới làm được điều đó.