Bài viết
Phép thử khử xanh methylen trong sữa: nguyên lý và giới hạn
Một sinh viên giơ hai ống sữa lên. Một ống chuyển sang màu trắng trong một giờ. Ống còn lại vẫn xanh suốt năm giờ. Cô chỉ vào ống màu xanh và nói rằng sữa này uống được an toàn.
Kết luận đó cho thấy cách hiểu sai về phép thử. Phép thử sữa bằng xanh methylen không xác định tính an toàn. Nó cho biết quần thể vi sinh vật trong ống làm giảm thế oxy hóa–khử nhanh đến mức nào trong các điều kiện cố định. Kết quả khử chậm nghĩa là hoạt động chuyển hóa tổng thể trong mẫu thấp. Nó không cho biết những vi sinh vật nào đang hiện diện, có tác nhân gây bệnh trong số đó hay không, hoặc sữa đã được thanh trùng đúng cách hay chưa.
Sự phân biệt này rất quan trọng vì phép thử trông có vẻ thuyết phục. Màu xanh biến mất. Đồng hồ cho ra một con số. Các con số dễ khiến người ta diễn giải quá mức. Bài viết này giữ lại cách diễn giải hữu ích và ngăn cách diễn giải thiếu an toàn.
Quá trình khử thực sự đo gì
Xanh methylen có màu xanh ở trạng thái oxy hóa và gần như không màu khi bị khử thành dạng leuco của xanh methylen. Sữa tươi chứa oxy hòa tan, giúp thuốc nhuộm giữ màu xanh. Vi khuẩn hô hấp và lên men tiêu thụ lượng oxy này và giải phóng các hợp chất có tính khử. Khi thế oxy hóa–khử giảm đủ thấp, thuốc nhuộm nhận electron và mất màu. Giáo trình vi sinh vật học sữa của Đại học Guelph mô tả cùng một trình tự: oxy bị loại bỏ, sau đó các chất có tính khử được hình thành trong quá trình chuyển hóa của vi khuẩn.
Nghiên cứu kinh điển trên tạp chí Journal of Dairy Science mô tả đây là quá trình hai giai đoạn: trước tiên hệ vi sinh vật làm cạn kiệt oxy, sau đó các thành phần của sữa khử thuốc nhuộm nhanh chóng. Vì vậy, nên hiểu phép thử khử xanh methylen trong sữa là phép đánh giá chức năng phản ánh hoạt động chuyển hóa tổng hợp, chứ không phải phép đếm tế bào. Đặc tính oxy hóa–khử của xanh methylen giải thích cơ sở hóa học của sự chuyển đổi này.
Oxy đảo ngược trạng thái tại điểm kết thúc. Thuốc nhuộm dạng leuco đã bị khử khi tiếp xúc với không khí sẽ bị oxy hóa trở lại và chuyển sang màu xanh. Vì vậy, lắc, rót, dùng ống rộng và để khoảng không phía trên mẫu lớn đều làm chậm kết quả. Một vòng xanh mỏng thường còn lại ở bề mặt tiếp xúc với không khí sau khi phần sữa bên dưới đã mất màu. Các quy trình tiêu chuẩn chấp nhận vòng này thay vì chờ nó biến mất.
Loại vi sinh vật tạo thêm một yếu tố làm sai lệch kết quả. Vi khuẩn coliform và nhiều vi sinh vật lactic khử thuốc nhuộm nhanh. Nhiều vi sinh vật ưa lạnh và vi sinh vật chịu nhiệt khử chậm hoặc hầu như không khử. Hai mẫu sữa có cùng số đếm trên đĩa có thể mất màu xanh cách nhau nhiều giờ. Chỉ riêng điều đó đã đủ để loại trừ việc quy đổi thời gian thành số khuẩn lạc.
Quy trình phòng thí nghiệm có kiểm soát
Các phiên bản tại hiện trường và trong giáo trình khác nhau về chi tiết, nên kết quả chỉ có giá trị trong phạm vi phương pháp đã tạo ra nó. Một phiên bản thông thường trong phòng thí nghiệm thực phẩm được thực hiện như sau:
- Thu thập sữa nguyên liệu sao cho ít tiếp xúc thêm với không khí nhất và làm lạnh ngay. Trộn bằng cách đảo nhẹ trước khi lấy mẫu.
- Cho 10 mL sữa vào ống vô trùng cùng với 1 mL dung dịch thuốc nhuộm làm việc. Một nồng độ làm việc được dùng rộng rãi là 0.005 phần trăm thuốc nhuộm, với tỷ lệ sữa trên thuốc nhuộm là 10 trên 1.
- Đậy nút ống, đảo nhẹ hai lần và đặt vào bể điều nhiệt trong vòng vài phút. Nhiệt độ ủ điển hình là 35 đến 38 độ Celsius, tùy tiêu chuẩn cụ thể. Ghi lại tiêu chuẩn bạn áp dụng.
- Che chắn các ống khỏi ánh sáng trong khi ủ, vì ánh sáng làm tăng tốc quá trình khử.
- Đọc kết quả ở phút thứ 30, sau đó theo các khoảng thời gian cố định. Điểm kết thúc là thời điểm màu trong ống giống mẫu sữa đun sôi đối chiếu hoặc đạt mức mất màu được quy trình quy định.
- Giữ một ống không xử lý lấy từ cùng mẫu sữa làm đối chứng trực quan nếu phương pháp yêu cầu.
Sổ tay kiểm nghiệm sữa của FAO đưa ra một phiên bản tại hiện trường cụ thể của trình tự này, với 10 mL sữa cộng 1 mL thuốc nhuộm, đậy nút, đảo nhẹ, ủ ở khoảng 37 đến 38 độ và đọc kết quả mỗi 30 phút. Các ống đối chứng dùng sữa đun sôi để phá hủy hệ khử tự nhiên và làm mốc so sánh màu.
Sơ đồ trên xác định phạm vi các điều kiện cần kiểm soát. Cùng thể tích, cùng thuốc nhuộm, cùng nhiệt độ, cùng cách trộn, cùng biện pháp che chắn ánh sáng, cùng quy tắc xác định điểm kết thúc. Thay đổi bất kỳ yếu tố nào thì thời gian đo được cũng thay đổi theo. Đó là lý do các phiên bản thử tại nhà dùng nồng độ thuốc nhuộm tùy ý không thể so sánh với các mức phân hạng trong phòng thí nghiệm.
Thời gian khử cho biết điều gì
Thời gian dài hơn nghĩa là hoạt động tổng thể thấp hơn trong các điều kiện đã nêu. Thời gian ngắn hơn nghĩa là hoạt động tổng thể cao hơn. Các bảng dùng trong giảng dạy về sữa gán những mức phân hạng sơ bộ cho các khoảng thời gian đó, chẳng hạn 5 giờ trở lên là rất tốt và dưới 30 phút là kém trong một hệ thống phân hạng dựa trên BIS.
Điều cần rút ra là sự khác biệt giữa các hệ thống. Kết quả 5 giờ không có mức phân hạng chung áp dụng ở mọi nơi. Nó thuộc về quy trình đã định nghĩa mức phân hạng đó. Vì vậy, cách báo cáo có cơ sở là:
MBRT bằng X giờ theo phương pháp được nêu tên, tương ứng với mức phân hạng của phương pháp đó.
Không bao giờ được báo cáo MBRT bằng X đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mL. Hướng dẫn dựa trên Standard Methods nêu rằng không nên báo cáo kết quả khử thuốc nhuộm dưới dạng số lượng vi khuẩn. Quy trình nhuộm đơn bằng xanh methylen cũng trả lời một câu hỏi khác, vì nó cho thấy hình dạng tế bào dưới kính hiển vi thay vì hoạt động tổng thể trong ống.
Bảng diễn giải và giới hạn
Bảng này là tài liệu tham chiếu gốc của bài viết. Hãy đọc toàn bộ từng hàng. Không ô nào có thể được diễn giải riêng lẻ.
| Quan sát hoặc nhận định | Điều nó cho biết | Điều nó không thể chứng minh | Các yếu tố gây nhiễu chính |
|---|---|---|---|
| Mất màu xanh nhanh, dưới 2 giờ trong một hệ thống đánh giá sữa nguyên liệu | Hoạt động khử cao, phù hợp với lượng vi sinh vật lớn hoặc khả năng bảo quản kém | Loài, số lượng chính xác, độc tố hoặc thanh trùng không đạt | Bảo quản ở nhiệt độ ấm, hệ vi sinh vật có nhiều coliform, ánh sáng, lượng thuốc nhuộm thấp |
| Thời gian trung gian, 2 đến 4 giờ | Hoạt động ở mức vừa; chỉ phân hạng trong hệ thống đã nêu | Tính an toàn hoặc sự vắng mặt của vi sinh vật khử chậm | Nhiệt độ ủ cao, khác biệt về mức tiếp xúc với không khí, tách chất béo |
| Khử chậm, 5 giờ trở lên | Hoạt động tổng thể thấp trong hệ thống đó | Không có tác nhân gây bệnh, đã thanh trùng hoặc an toàn về mặt hóa học | Dư lượng kháng sinh, chất bảo quản, lượng oxy hòa tan tăng thêm, lượng thuốc nhuộm cao |
| Vòng xanh còn ở bề mặt trong khi phần sữa bên dưới mất màu | Oxy hóa trở lại tại bề mặt tiếp xúc với không khí, một hiệu ứng biên bình thường | Phép thử thất bại hoặc phản ứng chưa hoàn tất | Ống rộng, nút đậy lỏng, mở nhiều lần để kiểm tra |
| Ống chuyển trắng sau khi ủ sữa đã gia nhiệt | Hệ khử bị biến đổi cùng với hoạt động còn lại sau gia nhiệt | Việc gia nhiệt tương đương với quy trình thanh trùng đã được thẩm định | Tổn thương do nhiệt, phục hồi trong khi ủ, nhiễm bẩn về sau |
| Bất kỳ giá trị MBRT đơn lẻ nào được nêu mà không kèm phương pháp | Không rõ điều kiện thử | Bất kỳ mức phân hạng hoặc số đếm nào | Công thức thuốc nhuộm, tỷ lệ, nhiệt độ, cách trộn và quy tắc xác định điểm kết thúc đều không được báo cáo |
Các phép kiểm tra dựa trên sự sinh trưởng, chẳng hạn sử dụng môi trường nuôi cấy vi khuẩn, vẫn là cách để định lượng và phân lập. Ống thử khử dùng để sàng lọc. Đĩa nuôi cấy dùng để nhận diện và đếm.
Những điều phép thử không thể chứng minh về tính an toàn
Kết quả khử chậm không thể chứng minh rằng không có tác nhân gây bệnh. Một tác nhân gây bệnh hiện diện ở lượng có ý nghĩa về mặt lâm sàng có thể chỉ đóng góp rất ít vào mức tiêu thụ oxy tổng thể. Việc phát hiện tác nhân gây bệnh thuộc về các phương pháp đặc hiệu cho từng vi sinh vật; Standard Methods hiện hành xem đây là lĩnh vực riêng, tách biệt với sàng lọc chất lượng chung.
Phép thử không thể xác minh việc thanh trùng. Việc xác minh xử lý nhiệt sử dụng phép thử phosphatase kiềm hoặc một phương pháp đã được thẩm định khác theo hướng dẫn vệ sinh sữa của Codex. Một ống trắng hay xanh không cho biết lịch sử thời gian–nhiệt độ của lô sữa.
Phép thử không thể chứng nhận an toàn thực phẩm. Tính an toàn phụ thuộc vào tác nhân gây bệnh, độc tố đã hình thành sẵn, dư lượng thuốc, chất ô nhiễm hóa học, lịch sử chuỗi lạnh và sự nhiễm bẩn sau khi lấy mẫu. Codex xem an toàn sữa là một chuỗi biện pháp kiểm soát thay vì một kết quả sàng lọc duy nhất.
Bối cảnh phòng thí nghiệm thực phẩm không phải là thử nghiệm tại nhà
Trong phòng thí nghiệm sữa, phép thử được dùng để sàng lọc sữa đầu vào, so sánh các nhà cung cấp theo thời gian hoặc giảng dạy vi sinh vật học oxy hóa–khử dưới sự giám sát. Mẫu có thể truy xuất nguồn gốc. Thuốc thử được chuẩn hóa. Nhiệt độ được ghi lại. Chất thải được đưa đi xử lý theo quy trình phòng thí nghiệm.
Thử nghiệm tại nhà không có những điều đó. Thể tích đo trong bếp chỉ là gần đúng. Nồng độ thuốc nhuộm bán trực tuyến khác nhau rất nhiều. Việc ủ thường diễn ra trong một căn phòng ấm thay vì bể điều nhiệt đã được hiệu chuẩn. Màu vẫn thay đổi, khiến kết quả có vẻ đáng tin dù mọi biện pháp kiểm soát tạo nên ý nghĩa của nó đều thiếu vắng.
Rủi ro đáng lo hơn nằm ở hành vi. Một ống màu xanh tại nhà dễ khiến người ta uống sữa chưa thanh trùng mà phòng thí nghiệm vẫn sẽ gửi đi đếm trên đĩa, sàng lọc tác nhân gây bệnh và kiểm tra dư lượng. Phép thử sữa bằng xanh methylen được thiết kế để phân hạng sữa nguyên liệu khi tiếp nhận, không phải để xác nhận sữa đủ an toàn để uống. Phép sàng lọc bằng resazurin nhanh hơn cũng có cùng giới hạn: đọc màu nhanh hơn nhưng vẫn không trả lời được câu hỏi về tác nhân gây bệnh.
Quy tắc ngắn gọn cho bàn thí nghiệm
Chuẩn hóa thuốc nhuộm, tỷ lệ, nhiệt độ, cách trộn, ánh sáng và điểm kết thúc. Báo cáo thời gian kèm tên phương pháp và mức phân hạng. Diễn giải thời gian đo được cùng với lịch sử bảo quản, loại hệ vi sinh vật, dư lượng và chất lượng lấy mẫu. Thời gian ngắn báo hiệu hoạt động cần được tìm hiểu thêm. Thời gian dài không bao giờ chứng nhận tính an toàn.