Đo tác động của xanh methylen lên ty thể: oxy, ATP và điện thế màng

Giả sử một phòng thí nghiệm thêm xanh methylen vào các ty thể bị suy giảm hô hấp và quan sát thấy mức tiêu thụ oxy tăng lên. Câu kết luận dễ được viết ra là thuốc nhuộm đã khôi phục chức năng ty thể. Câu đó có thể sai. Thông lượng oxy, tổng hợp ATP và điện thế màng là ba khái niệm riêng biệt. Chúng cùng thuộc một bào quan, giống như sao lưu, đồng bộ và chia sẻ cùng sử dụng một thư mục đám mây: có liên quan, nhưng tuân theo các quy tắc khác nhau. Nhầm lẫn giữa chúng sẽ dẫn đến diễn giải sai, ngay cả khi mọi phép đo đều chính xác về mặt kỹ thuật.

Xanh methylen dễ gây ra sự nhầm lẫn này vì nó tham gia vào chính hệ thống đang được đo. Nó là chất thực hiện chu trình oxy hóa khử, nhận electron ở phía trước và cho electron ở phía sau của chuỗi; là cation ưa lipid tích tụ trong ty thể có trạng thái năng lượng cao; đồng thời là hợp chất có màu xanh đậm, hấp thụ và phát xạ ánh sáng trong cùng các dải với những đầu dò thông dụng. Một chỉ số đo đơn lẻ không thể bao quát tất cả những đặc điểm đó. Cách tiếp cận đáng tin cậy, được thể hiện xuyên suốt các nghiên cứu về ty thể tại Budapest, là đo thông lượng oxy cùng tốc độ tổng hợp ATP, điện thế màng và lượng hydro peroxide giải phóng, với các đối chứng dành riêng cho thuốc nhuộm ở từng bước.

Đo hô hấp đo thông lượng oxy, không phải năng lượng tạo ra

Phép đo hô hấp độ phân giải cao, dù dùng Oroboros Oxygraph hay máy phân tích thông lượng ngoại bào Seahorse, chỉ cho biết một điều: oxy đang được khử nhanh đến mức nào. Nó không cho biết có bao nhiêu proton được bơm trên mỗi electron, bao nhiêu gradient được duy trì, hay ATP synthase có sử dụng gradient đó hay không.

Thuật ngữ rất quan trọng. Ở ty thể phân lập, cơ chất không kèm ADP cho biết hô hấp do rò rỉ proton, cơ chất với ADP ở mức bão hòa cho biết năng lực phosphoryl hóa oxy hóa, và chuẩn độ chất phá ghép cho biết năng lực truyền electron tối đa. Ở tế bào nguyên vẹn, các chỉ số tương ứng của Seahorse là hô hấp nền, hô hấp gắn với ATP nhạy với oligomycin, rò rỉ proton, hô hấp tối đa được xác định bằng FCCP và tiêu thụ oxy ngoài ty thể không bị ức chế bởi rotenone cộng antimycin. Gọi các đầu ra của Seahorse là Trạng thái 3 và Trạng thái 4 là gán cho chúng mức độ chính xác mà loại mẫu này không cho phép, như khung Mito Stress Test của Agilent đã làm rõ.

Xanh methylen phá vỡ mối liên hệ trực giác giữa nhiều oxy hơn và nhiều năng lượng hơn. Ở ty thể não chuột lang phân lập, thuốc nhuộm ở nồng độ 100 nM đến 1 uM làm tăng tiêu thụ oxy lúc nghỉ khi dùng các cơ chất glutamate cộng malate, succinate và alpha-glycerophosphate, với mức tăng khoảng 64 phần trăm trên alpha-glycerophosphate; tuy nhiên, hô hấp được kích thích bởi ADP ở ty thể khỏe mạnh về cơ bản không thay đổi, theo nghiên cứu về ty thể não phân lập. Vì hô hấp do rò rỉ tăng trong khi thông lượng được kích thích bởi ADP không đổi, tỷ số kiểm soát hô hấp tính toán được sẽ giảm. Mức giảm đó không có nghĩa là thuốc nhuộm đã làm tổn thương ty thể. Nó có nghĩa là thuốc nhuộm bổ sung một chu trình oxy hóa khử tiêu thụ oxy bên cạnh hô hấp bình thường. Một phép đo tiêu thụ oxy với xanh methylen chỉ báo cáo mức tăng đã đo được một quá trình hóa học có thật nhưng chưa nói lên điều gì về sự bảo toàn năng lượng.

Các thí nghiệm phục hồi cho thấy cùng một khoảng cách ở quy mô lớn hơn. Khi Phức hợp I bị chặn, thông lượng oxy phục hồi khoảng ba lần trong khi tổng hợp ATP chỉ phục hồi khoảng 1.5 lần. Nhiều oxy hơn đến điện cực, nhưng phần đóng góp vào việc tạo ATP ít hơn. Mọi kết luận về sự cải thiện phosphoryl hóa oxy hóa đều cần dữ liệu ATP, lý tưởng là biểu thị dưới dạng tỷ số ATP trên oxy và nêu rõ quy ước dùng cho mẫu số.

Phép đo ATP đo tốc độ tổng hợp, không thể thay bằng hàm lượng

Phép đo ATP trả lời một câu hỏi khác: bao nhiêu ATP được tạo ra trong một đơn vị thời gian. Chỉ số động học, dù là phát quang luciferase đom đóm được theo dõi trong nhiều phút hay phép đo enzym ghép cặp hexokinase cộng glucose-6-phosphate dehydrogenase được đọc ở 340 nm, đều cho ra tốc độ. Một phép đo tổng ATP tại một điểm cuối duy nhất cho ra hàm lượng, phản ánh tổng hợp trừ tiêu thụ và tự nó không cho biết nhiều về phosphoryl hóa oxy hóa.

Nhóm Budapest sử dụng phương pháp enzym ghép cặp với adenylate kinase bị ức chế, và nhận thấy xanh methylen ở nồng độ 1 đến 2 uM làm tăng sản xuất ATP ở mức vừa phải nhưng có ý nghĩa thống kê trong ty thể được xử lý bằng rotenone và antimycin. Đó là sự phục hồi thực sự, nhưng chỉ một phần. Nghiên cứu về độc tính TEGDMA cho kết quả theo cùng một hướng trong một mô hình khác: monomer nha khoa TEGDMA ở nồng độ 5 mM làm hô hấp gắn với Phức hợp I giảm mạnh từ khoảng 286 xuống 28 đơn vị thông lượng, và thuốc nhuộm ở nồng độ 2 uM phục hồi mức này lên khoảng 86.

Có hai đối chứng không thể thiếu khi dùng một hợp chất oxy hóa khử có màu. Thứ nhất, dùng oligomycin để xác định bao nhiêu phần tổng hợp ATP đo được phụ thuộc vào ATP synthase. Thứ hai, thực hiện phép thử thu hồi ATP bổ sung trong hệ không có tế bào, với lượng ATP đã biết cộng bộ thuốc thử đầy đủ và đúng các nồng độ thuốc nhuộm được sử dụng, tối thiểu là 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM và 2 uM. Thuốc nhuộm có thể hấp thụ ánh sáng phát ra, ức chế enzym chỉ thị hoặc làm thay đổi phản ứng oxy hóa khử của thuốc thử; hướng dẫn chung về phép đo luciferase khuyến nghị các phép kiểm tra đối chứng sinh hóa chính là để phát hiện loại nhiễu này. Đừng mặc định rằng 1 uM không gây sai lệch chỉ vì hiện tượng dập tắt huỳnh quang thường nặng hơn ở nồng độ cao hơn.

Đầu dò điện thế màng đo sự phân bố thuốc nhuộm, không phải thông lượng

Safranine O, TMRM và TMRE, rhodamine 123 và JC-1 đều là các cation có thể thấm qua màng. Chúng tích tụ trong chất nền ty thể mang điện tích âm theo cân bằng điện hóa, vì vậy huỳnh quang tổng thể phản ánh điện thế một cách gián tiếp thông qua vị trí của đầu dò. Không đầu dò nào trong số này đo ATP hay thông lượng electron.

Mỗi đầu dò phù hợp nhất với một loại mẫu. Safranine O phù hợp với ty thể phân lập và tế bào được làm thấm màng, thường ở nồng độ gần 2 uM với bước sóng kích thích gần 495 nm và phát xạ gần 585 nm, hoạt động trong chế độ dập tắt huỳnh quang, trong đó sự thu nhận đầu dò làm thay đổi huỳnh quang tổng thể. TMRM và TMRE phù hợp với tế bào nguyên vẹn khi nạp ở nồng độ nanomol thấp trong chế độ không dập tắt huỳnh quang; ở chế độ này, khử cực làm thuốc nhuộm thoát ra và huỳnh quang ty thể giảm. Khi nạp ở mức cao, chiều biến đổi của tín hiệu có thể đảo ngược do tự dập tắt huỳnh quang. JC-1 cung cấp tỷ số huỳnh quang xanh lá trên đỏ thuận tiện, nhưng phụ thuộc vào mức nạp và khối lượng ty thể, nên kém phù hợp cho công việc định lượng hơn TMRM được kiểm soát cẩn thận. Những đánh đổi này được tóm tắt trong một bài tổng quan được sử dụng rộng rãi về các đầu dò điện thế màng ty thể.

Xanh methylen gây nhiễu quang học ngay ở các nồng độ làm việc. Các dải hấp thụ gần 600 đến 665 nm của nó chồng lấp với phát xạ đỏ của đầu dò, nên hiệu ứng lọc trong, dập tắt huỳnh quang và hấp thụ ánh sáng kích thích đều có thể xảy ra. Thuốc nhuộm cũng là một cation ưa lipid thứ hai, có sự phân bố thay đổi theo chính điện thế đang được đo. Biện pháp phòng ngừa là đo kiểm chứng bằng nhiều đầu dò kết hợp với mẫu trắng: chỉ đầu dò, chỉ thuốc nhuộm, đầu dò cộng từng nồng độ thuốc nhuộm, khử cực hoàn toàn bằng FCCP làm mốc không, và lý tưởng là một đầu dò thứ hai có đặc tính quang học khác biệt. Nghiên cứu về đường vòng qua Phức hợp III đã tạo tiền lệ bằng cách lặp lại phép đo phục hồi điện thế màng với cả safranine O và TMRM sau khi ức chế bằng antimycin và myxothiazol, thu được cùng một sự phục hồi về mặt định tính. Một đầu dò quang học là gợi ý. Hai đầu dò độc lập là bằng chứng.

Ba loại mẫu, ba câu hỏi khác nhau

Ty thể phân lập, tế bào được làm thấm màng và tế bào nguyên vẹn không phải là những mức độ nhạy có thể hoán đổi của cùng một phép đo. Chúng là những khái niệm khác nhau với các nguyên lý vận hành khác nhau.

Ty thể phân lập giữ lại chuỗi truyền electron, màng trong và bộ máy trong chất nền, đồng thời loại bỏ màng sinh chất, bào tương và cấu trúc mạng lưới. Việc loại bỏ đó chính là mục đích: cơ chất, ADP, chất ức chế và nồng độ thuốc nhuộm được xác định chính xác, nhờ đó có thể xác định con đường liên quan. Đổi lại, nguồn cung cấp cơ chất tự nhiên, tín hiệu và nhu cầu năng lượng bị mất đi.

Tế bào được làm thấm màng giữ ty thể trong phần lớn cấu trúc tế bào, đồng thời cho cơ chất ngoại sinh và ADP đi qua màng sinh chất đã được mở. Đây là công cụ phù hợp để xác định khiếm khuyết ở con đường sử dụng cơ chất trong bối cảnh tế bào. Làm thấm màng quá mức sẽ gây tổn thương màng ngoài, và các yếu tố điều hòa trong bào tương bị rửa trôi.

Tế bào nguyên vẹn giữ lại mọi thứ: hàng rào màng sinh chất, các chất khử trong bào tương, sự vận chuyển cơ chất nội sinh, mạng lưới ty thể và nhu cầu ATP. Chúng gần với sinh lý nhất nhưng khó làm rõ cơ chế nhất, vì sự thu nhận, khử và giữ thuốc nhuộm trong các khoang đều định hình mức phơi nhiễm thực tế của ty thể.

Nghiên cứu TEGDMA chủ ý sử dụng cả ba cấp độ: ty thể não phân lập để khảo sát sự phục hồi oxy hóa và điện thế nhờ thuốc nhuộm; tế bào gốc tủy răng được làm thấm màng chủ yếu để xác định tổn thương nằm ở quá trình oxy hóa cơ chất gắn với Phức hợp I; và tế bào gốc nguyên vẹn để đánh giá tác động sinh lý ròng của thuốc nhuộm ở nồng độ 2 uM lên mức tiêu thụ oxy bị ức chế. Với những độc giả so sánh các chỉ số ty thể giữa các loại mẫu, bài giải thích đi kèm về cách xanh methylen vận chuyển electron qua chuỗi hô hấp cung cấp kiến thức nền về các con đường, còn hướng dẫn đọc nghiên cứu hô hấp với xanh methylen trình bày cách suy luận dựa trên nồng độ và chất ức chế.

Các đối chứng cần thiết cho thuốc nhuộm có hoạt tính oxy hóa khử

Một chất thực hiện chu trình oxy hóa khử cần danh sách đối chứng dài hơn chất ức chế thông thường, vì các phản ứng hóa học chỉ do thuốc nhuộm gây ra có thể mô phỏng quá trình sinh học.

Đối với phép đo hô hấp, chạy một buồng chỉ có dung dịch đệm để kiểm tra độ trôi, một buồng có dung dịch đệm cộng thuốc nhuộm nhưng không có vật liệu sinh học, thuốc nhuộm cộng bất kỳ chất khử ngoại bào nào có trong phép đo, và thêm rotenone cộng antimycin ở cuối để xác định tiêu thụ oxy ngoài ty thể trong tế bào nguyên vẹn. Lưu ý rằng thuốc nhuộm ở dạng khử bị oxy hóa trở lại bằng cách truyền electron cho oxy để tạo hydro peroxide, nên mẫu trắng chỉ có thuốc nhuộm nhưng không có chất cho electron sẽ đánh giá thấp mức tiêu thụ oxy trong hệ không có tế bào khi NADH hoặc NADPH hiện diện.

Đối với hydro peroxide, ưu tiên Amplex UltraRed đã hiệu chuẩn cộng peroxidase cải ngựa thay vì các thuốc nhuộm DCFDA không chọn lọc, xác minh bằng catalase và kiểm tra sự phụ thuộc vào chiếu sáng, vì thuốc nhuộm là chất nhạy quang. Nghiên cứu ty thể não nhận thấy gánh nặng peroxide tăng hơn bốn lần chỉ ở nồng độ thuốc nhuộm 100 nM, trong khi quá trình loại bỏ chậm lại; peroxide được tạo trực tiếp bởi thuốc nhuộm ở dạng khử mà không qua chất trung gian superoxide. Chi tiết về lựa chọn đầu dò và đối chứng ánh sáng được trình bày trong bài đi kèm về đo các dạng oxy phản ứng trong thí nghiệm dùng thuốc nhuộm, còn câu hỏi rộng hơn về khi nào peroxide đóng vai trò tín hiệu và khi nào trở thành gánh nặng được bàn luận cùng cân bằng oxy hóa khử tế bào và các tuyên bố về chống oxy hóa.

Đối với các kết luận về con đường, hãy kiểm tra cả hai vị trí ức chế của Phức hợp III: antimycin A tại vị trí Qi và myxothiazol tại vị trí Qo, cộng một phép kiểm tra chặn Phức hợp IV bằng cyanide ở cuối. Một nghiên cứu trước đây trên não chuột nhắt báo cáo rằng thuốc nhuộm phục hồi hô hấp bị chặn bởi rotenone nhưng không phục hồi hô hấp bị chặn bởi antimycin, trong khi nghiên cứu sau đó trên ba loài tìm thấy sự phục hồi một phần với cả hai chất ức chế và bằng chứng về sự khử trực tiếp cytochrome c. Hãy xem cơ chế đi đường vòng là phù hợp với dữ liệu mới hơn chứ chưa phải đã được xác lập, vì nồng độ thuốc nhuộm, vị trí ức chế, trạng thái cơ chất và sự phân bố thuốc nhuộm đều làm thay đổi con đường quan sát được.

Ma trận lựa chọn phép đo

Dùng bảng này để chọn phép đo dựa trên câu hỏi, thay vì làm ngược lại.

Để một kết luận có sức thuyết phục ở mức tối thiểu, cần dùng cùng các nồng độ thuốc nhuộm, 100 nM, 300 nM, 1 uM và 2 uM, để đo thông lượng oxy trong các điều kiện rò rỉ proton, ADP, oligomycin và chất phá ghép; tốc độ tổng hợp ATP; điện thế màng, tốt nhất bằng hai đầu dò; và lượng peroxide giải phóng đã hiệu chuẩn, với đối chứng catalase và đối chứng không có tế bào. Báo cáo bộ chỉ số liên kết: thông lượng oxy cộng tốc độ tạo ATP cộng ATP trên oxy cộng điện thế cộng peroxide. Bất kỳ con số nào trong số đó, nếu đứng riêng lẻ, cũng chỉ là một phép đo chưa có ý nghĩa rõ ràng.