Đọc hình thái khuẩn lạc E. coli và các vi khuẩn khác trên thạch EMB

Một sinh viên cấy ria mẫu chưa xác định lên thạch eosin methylene blue, ủ qua đêm rồi quay lại thấy một đĩa có các khuẩn lạc sẫm màu với ánh xanh lấp lánh. Trong sổ ghi chép, sinh viên viết: "E. coli, đã xác nhận." Kết luận đó vượt quá những gì đĩa thạch có thể chứng minh. Đĩa thạch cho thấy kiểu hình sinh trưởng và lên men trong những điều kiện cụ thể. Xác định loài là một kết luận riêng, cần có bằng chứng riêng.

Hướng dẫn này xem việc đọc kết quả trên thạch EMB là một nhiệm vụ diễn giải. Bài viết giải thích nguyên lý nền tảng, trình bày bộ hình minh họa các đĩa thạch kèm đối chứng và chỉ ra những trường hợp mà hình ảnh trong sách giáo khoa có thể gây hiểu nhầm.

Nguyên lý của đĩa thạch

Thạch EMB vừa có tính chọn lọc vừa có tính phân biệt. Các thuốc nhuộm eosin Y và methylene blue ức chế nhiều vi sinh vật Gram dương, nên môi trường ưu tiên sự phát triển của vi sinh vật Gram âm. Các thuốc nhuộm này cũng đóng vai trò chất chỉ thị: khi một vi sinh vật lên men đường có sẵn và tạo đủ axit tại chỗ, khuẩn lạc hấp thu nhiều thuốc nhuộm và chuyển sang màu tím sẫm đến xanh đen. Khi axit được tạo ra mạnh, bề mặt khuẩn lạc có thể xuất hiện ánh kim xanh lục óng ánh. Quy trình của ASM dành cho đĩa thạch eosin methylene blue mô tả sự kết hợp giữa tính chọn lọc và tính phân biệt này, đồng thời cung cấp ảnh tham khảo phục vụ giảng dạy.

Có một chi tiết quan trọng cần kiểm tra trước khi đọc bất kỳ kết quả nào: công thức môi trường đang sử dụng. Công thức Holt Harris Teague cũ chứa cả lactose và sucrose, còn Levine EMB chỉ chứa lactose. Một vi sinh vật lên men sucrose nhưng không lên men lactose, như nhiều chủng Serratia marcescens phân lập, có thể biểu hiện khác nhau trên hai phiên bản này. Tài liệu của nhà sản xuất về môi trường EMB nêu rõ sự khác biệt về công thức này. Hãy ghi nhà sản xuất và công thức môi trường vào sổ cùng với kết quả.

Thạch EMB đã pha nhưng chưa cấy thường có màu nâu đỏ đến tím đỏ, đôi khi hơi ánh xanh lục hoặc có kết tủa mịn. Màu nền đó không phải là dấu hiệu sinh trưởng. Mỗi lần đọc, hãy so sánh với một đĩa chưa cấy hoặc màu nền đã được ghi nhận, và đọc đĩa cấy ban đầu sau khoảng 18 đến 24 giờ ủ hiếu khí ở 35 đến 37 C, trừ khi quy trình giảng dạy có chỉ định khác. Thời gian ủ kéo dài có thể làm thay đổi biểu hiện lên men.

Cách quan sát đĩa thạch

Sử dụng hai kiểu chiếu sáng. Trước hết, quan sát đĩa dưới ánh sáng phản xạ hoặc ánh sáng xiên và nghiêng đĩa: ánh kim có tính óng ánh và có thể xuất hiện hoặc biến mất tùy góc nhìn. Sau đó, quan sát bằng ánh sáng truyền qua để đánh giá màu khuẩn lạc và phần tâm sẫm màu. Hãy quan sát các khuẩn lạc tách biệt rõ, vì mật độ dày và các khuẩn lạc lân cận làm thay đổi sự tích tụ axit tại chỗ, có thể làm giảm hoặc tăng biểu hiện màu. Bộ ảnh của ASM minh họa trực tiếp điều này: E. coli trong nuôi cấy hỗn hợp có thể mất ánh kim thường thấy vì các vi sinh vật xung quanh làm thay đổi môi trường axit.

Đưa các đối chứng vào bất cứ khi nào bài thực hành cho phép. Một bộ đối chứng thường dùng trong giảng dạy gồm E. coli ATCC 25922 cho kiểu hình xanh đen và ánh kim, một vi khuẩn không lên men như Salmonella Typhimurium ATCC 14028 hoặc Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 cho kiểu hình không màu, và một vi khuẩn Gram dương như Enterococcus faecalis hoặc Staphylococcus aureus làm đối chứng ức chế, như được liệt kê trong các bảng kiểm soát chất lượng tiêu chuẩn cho môi trường EMB. Nếu đối chứng dương không có ánh kim, hãy xem xét điều kiện ủ, mật độ khuẩn lạc hoặc công thức môi trường trước khi nghi ngờ mẫu chưa xác định.

Bộ hình minh họa đĩa thạch

Các đĩa dưới đây là hình minh họa được tạo dựng, không phải ảnh chụp mẫu nuôi cấy thật. Chúng cho thấy dạng biểu hiện cần tìm, chứ không phải sắc độ chính xác của bất kỳ chủng riêng lẻ nào. Hãy so sánh chúng với ảnh tham khảo của ASM và với các đĩa thật trong phòng thực hành.

Đĩa 1: Escherichia coli trên thạch EMB, vi khuẩn lên men lactose mạnh

E. coli trên thạch EMB thường có màu tím sẫm đến xanh đen, hay có tâm sẫm màu và ánh kim xanh lục do tạo axit mạnh. Ánh kim là dấu hiệu nổi tiếng mà sinh viên thường tìm kiếm, nhưng hãy xem đó là bằng chứng hỗ trợ chứ không phải đặc điểm định danh. Cường độ ánh kim thay đổi theo chủng, thời gian ủ, mật độ khuẩn lạc và góc nhìn. Không có ánh kim không loại trừ E. coli, còn một khuẩn lạc sẫm màu không có ánh kim có thể gợi ý nhiều vi khuẩn lên men khác. Hãy chọn một khuẩn lạc tách biệt rõ cho mọi bước tiếp theo, thay vì đọc từ vùng có khuẩn lạc mọc dày.

Đĩa 2: Klebsiella pneumoniae trên thạch EMB, vi khuẩn lên men tạo khuẩn lạc nhầy

Klebsiella pneumoniae trên thạch EMB thường tạo các khuẩn lạc lớn, bóng, nhầy, có sắc hồng tím đến nâu tím, thường có tâm sẫm màu nhưng thường không có ánh kim rõ. Hình thái tương tự cũng gặp ở các vi khuẩn lên men có quan hệ gần như Enterobacter. Tính nhầy và kích thước khuẩn lạc là một phần của việc đọc kết quả: một khuẩn lạc hồng nhỏ, phẳng có ý nghĩa diễn giải khác với một khuẩn lạc nhầy lớn, lồi dạng vòm. Cũng như với E. coli, đĩa thạch gợi ý một kiểu hình lên men; việc gọi tên ở cấp loài cần được xác nhận bằng các xét nghiệm sinh hóa mô tả bên dưới.

Đĩa 3: Salmonella trên thạch EMB và các vi khuẩn không lên men khác, khuẩn lạc không màu

Salmonella trên thạch EMB và các vi khuẩn không lên men lactose tương tự, bao gồm Shigella và nhiều chủng Pseudomonas phân lập, thường phát triển thành khuẩn lạc không màu đến trong mờ hoặc màu hổ phách nhạt. Một số công thức và điều kiện tạo sắc hồng phớt, nên khuẩn lạc hồng nhạt không mặc nhiên là vi khuẩn lên men. EMB không phân biệt Salmonella với Shigella hoặc với các vi khuẩn không lên men khác; sự phân biệt đó thuộc về các xét nghiệm sau này. Cũng cần lưu ý rằng đã có ghi nhận về các chủng Salmonella lên men lactose tạo khuẩn lạc ánh kim giống E. coli, thêm một lý do cho thấy chỉ một đĩa thạch không thể đưa ra kết luận cuối cùng.

Đĩa 4: Serratia marcescens và bẫy công thức môi trường

Serratia marcescens cần có phần riêng vì sinh viên thường mong đợi khuẩn lạc đỏ rồi đọc sai kết quả. Phần lớn các chủng phân lập lâm sàng không lên men lactose, nên trên Levine EMB chúng thường nhạt màu hoặc chỉ lên màu nhẹ. Vì nhiều chủng phân lập lên men sucrose, công thức có chứa sucrose có thể cho phản ứng sẫm màu hơn hoặc phản ứng liên quan đến axit rõ hơn. Cũng đừng mong đợi sắc tố prodigiosin đỏ điển hình ở 35 đến 37 C; khả năng tạo sắc tố không ổn định ở nhiệt độ tủ ủ. Khi quy trình đề cập đến Serratia marcescens trên thạch EMB, hãy kiểm tra công thức môi trường mà nhận định đó dựa vào. Một bài tổng quan về chuyển hóa của Serratia tóm tắt đặc điểm không lên men lactose và khả năng lên men sucrose thay đổi giữa các chủng, là nguyên nhân của bẫy này.

Đĩa 5: đối chứng và các vi sinh vật bị ức chế

Các vi sinh vật Gram dương như Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus và Bacillus nhìn chung bị ức chế hoặc hạn chế phát triển rõ rệt trên thạch EMB, mặc dù sự ức chế không tuyệt đối với mọi chủng. Một bộ đối chứng giúp việc đọc kết quả có cơ sở: đối chứng E. coli nên phát triển tốt với màu xanh đen và ánh kim, đối chứng không lên men nên phát triển thành khuẩn lạc không màu, còn đối chứng ức chế nên phát triển rất ít hoặc không phát triển. Nếu đối chứng ức chế phát triển tốt, khả năng chọn lọc đã thất bại và mọi kết quả đọc khác trên lô môi trường đó đều đáng nghi ngờ. Các phương pháp nhuộm trả lời một câu hỏi khác với môi trường nuôi cấy; về phần nhuộm tiêu bản trong phòng thí nghiệm, xem bộ hình nhuộm methylene blue.

So sánh trong phạm vi giới hạn

Ba câu sau tóm tắt các biểu hiện dễ gây hiểu nhầm. Sẫm màu không đồng nghĩa với E. coli, vì Klebsiella, Enterobacter và các vi khuẩn lên men khác có thể tạo tâm sẫm màu mà không có ánh kim. Màu hồng không đồng nghĩa với Klebsiella, vì các vi khuẩn lên men vừa hoặc chậm và một số vi khuẩn thường được xếp là không lên men có thể có màu hồng hoặc tím nhạt. Ánh kim không đồng nghĩa với việc đã xác định chắc chắn E. coli, vì các vi khuẩn lên men mạnh khác cũng có thể tạo ánh kim. Quy trình giảng dạy và các hình nuôi cấy hỗn hợp đi kèm minh họa từng trường hợp suy luận không đúng này.

Giới hạn của việc xác nhận

Thạch EMB cho biết kiểu hình, không phải loài. Các vi sinh vật khác nhau có thể có cùng một hình thái khuẩn lạc, và một vi sinh vật có thể khác với hình ảnh trong sách giáo khoa tùy theo chủng, tuổi khuẩn lạc, mật độ mọc, công thức môi trường và điều kiện ủ. Vì vậy, các quy trình giảng dạy và lâm sàng xem hình thái trên EMB là căn cứ định danh sơ bộ.

Một quy trình hợp lý cho sinh viên là: mô tả khuẩn lạc tách biệt (kích thước, màu, tâm, ánh kim dưới ánh sáng xiên, tính nhầy), ghi lại công thức môi trường, thời gian và nhiệt độ ủ, cùng các đối chứng; sau đó cấy chuyền một khuẩn lạc tách biệt rõ để thu được nuôi cấy thuần trước khi thực hiện bất kỳ xét nghiệm xác nhận nào. Các bước tiếp theo thường gồm nhuộm Gram kết hợp các phản ứng IMViC để định danh sơ bộ E. coli và vi khuẩn coliform, TSI hoặc KIA và các bộ xét nghiệm sinh hóa đặc hiệu cho từng vi sinh vật đường ruột, cùng phương pháp huyết thanh học, MALDI TOF hoặc phương pháp định danh đã được thẩm định khác khi nhiệm vụ yêu cầu. Để tìm hiểu vai trò của EMB trong nhóm môi trường chọn lọc và phân biệt dành cho vi khuẩn đường ruột, hãy xem các tài liệu nhập môn về môi trường nuôi cấy vi khuẩn đường ruột và bước nhuộm Gram tiếp theo. Với câu hỏi liên quan về những gì một tiêu bản nhuộm xanh có thể và không thể chứng minh, bộ hình nhuộm methylene blue cũng phân biệt rõ quan sát và kết luận theo cùng tinh thần này.

Hãy ghi quan sát trước khi đưa ra kết luận. "Các khuẩn lạc xanh đen sẫm có ánh xanh lục thay đổi theo góc nhìn trên Levine EMB tại thời điểm 24 giờ, phù hợp với sự lên men lactose mạnh" là nhận định có cơ sở. "E. coli, đã xác nhận" đòi hỏi bước xác nhận mà riêng đĩa thạch không thể cung cấp.