Ai đã phát triển thuốc nhuộm máu cho màu tím? Xanh methylen, Malachowski, Romanowsky và Giemsa

Eosin có màu đỏ. Xanh methylen có màu xanh. Trộn hai chất này, phủ hỗn hợp lên một tiêu bản máu đã khô, và một số phần của tiêu bản sẽ có màu tím.

Không phải phần nào cũng vậy. Trong một tiêu bản được chuẩn bị tốt, nhân bạch cầu bắt màu đỏ tím, và chất nhiễm sắc bên trong ký sinh trùng sốt rét cũng bắt màu đó, còn các hồng cầu xung quanh vẫn màu hồng và tế bào chất vẫn màu xanh xám. Chính màu tím giúp phân biệt các loại tế bào.

Không lọ nào chứa màu tím. Màu này chỉ xuất hiện khi một sản phẩm phân hủy cụ thể của xanh methylen gặp eosin trên lam kính, và vào những năm 1880 và 1890, không ai biết sản phẩm đó tồn tại, chứ đừng nói đến việc biết nó là gì. Những người tìm cách tạo ra màu này làm việc riêng lẻ với các thuốc nhuộm không tinh khiết, không có cách đáng tin cậy để xác định trong một lọ có gì sau khi nó nằm trên kệ hai tháng.

Đó là lý do câu hỏi trong tiêu đề có hơn một câu trả lời hợp lý, và cũng là lý do câu trả lời đã thay đổi vào năm 2011.

Những gì quan sát được thay đổi theo hỗn hợp

Thuốc nhuộm này không được phát minh trong một lần. Nó hình thành qua nhiều bước tích lũy. Mỗi thay đổi trong hỗn hợp đem lại đúng một thông tin mới có thể quan sát được, và trình tự xuất hiện của những thông tin ấy là cách rõ ràng nhất để hiểu lịch sử này.

Điều quan trọng nằm ở diễn tiến trong cột cuối. Mỗi bước tiến đều mở rộng dải màu, và mỗi lần dải màu mở rộng lại giúp nhìn thấy thêm một cấu trúc. Màu tím không phải phần tô điểm cho kỹ thuật; nó tạo nên khác biệt giữa việc thấy có ký sinh trùng và việc thấy ký sinh trùng được cấu tạo như thế nào. Hành trình của chính thuốc nhuộm từ nhà máy thuốc nhuộm BASF đến y học là một lịch sử dài hơn, với những tài liệu riêng. Toàn bộ trình tự trên, cùng nguồn cho từng mục, được lưu trong dòng thời gian những người đóng góp có liên kết nguồn.

Hình: cùng sáu hỗn hợp đó được thể hiện qua những gì có trong đĩa và những gì tạo ra từ chúng. Các vòng tròn biểu thị thuốc nhuộm; các ô bên dưới biểu thị những màu mà các thuốc nhuộm ấy có thể tạo ra trên tiêu bản máu. Trước năm 1890 không có ô đỏ tím nào, và sau năm đó không hỗn hợp nào thiếu ô này.

Người chủ động dùng borax

Ernst Malachowski là bác sĩ tại Breslau, nay là Wrocław, dành sự nghiệp cho công việc khám chữa bệnh tư và một phòng khám nhỏ ông điều hành cùng một đồng nghiệp, đồng thời làm thí nghiệm trong thời gian riêng. Ông sinh tại Strzelno ngày 12 tháng 3 năm 1857, học y tại Đại học Breslau, và từ 1882 đến 1887 làm trợ lý chuyên khoa nội tại Bệnh viện All Saints, khi đó là bệnh viện lớn thứ hai ở Đức.

Ông bắt đầu vào năm 1888 với phương pháp nhuộm kép của Chęciński và Plehn. Trong một tiêu bản làm năm 1889, ông thấy chất nhiễm sắc trong nhân ký sinh trùng sốt rét bắt màu khác với tế bào chất, nhưng sau đó nhận ra mình không thể tái lập kết quả này. Ông thử axit hóa xanh methylen, khiến kết quả tệ hơn. Ông thử kiềm hóa nó bằng borax, và lần nào cũng thành công. Ông trình diễn công khai phương pháp này ngày 15 tháng 6 năm 1890 và công bố mô tả đầy đủ hơn vào tháng 8 năm 1891, trong đó có hướng dẫn dùng borax. Ông ghi nhận rằng quá trình nhuộm mất hai mươi bốn giờ và kết quả dễ tái lập.

Hai mươi bốn giờ là khoảng thời gian dài đối với một phòng xét nghiệm chẩn đoán, và bài báo của ông không nhấn mạnh màu tím đỏ của nhân ký sinh trùng. Dù vì lý do gì, không ai tiếp tục việc chủ động kiềm hóa xanh methylen cho đến khi Nocht thực hiện lại vào năm 1898. Malachowski không bao giờ viết về nhuộm máu nữa.

Lý do cho đến gần đây người ta biết rất ít về ông nằm ở tư liệu lưu trữ, chứ không phải một điều bí ẩn. Hầu như không có dấu vết nào về cuộc đời ông còn lại trong y văn, và những gì còn lại đều được lưu truyền qua một con đường duy nhất. Con gái ông, Marie, rời Đức đến London năm 1939, phục vụ trong Quân đội Anh rồi định cư tại Canada, và bộ sưu tập giấy tờ gia đình của bà cuối cùng được lưu tại Viện Leo Baeck ở New York. Anh trai bà, Leo, thiệt mạng trong Chiến tranh thế giới thứ nhất. Chị gái bà, Eva, bị trục xuất từ Breslau đến trại trung chuyển Izbica vào tháng 4 năm 1942 và không bao giờ trở về. Mẹ bà, Hedwig, tự kết liễu đời mình ngày 22 tháng 4 năm 1942 thay vì chờ chịu cùng số phận bị trục xuất. Malachowski đã qua đời năm 1934, trước tất cả những biến cố ấy.

Một lịch sử gia đình kết thúc như vậy cũng là một lịch sử gia đình không còn được trích dẫn. Hai bài báo đưa Malachowski trở lại lịch sử phát triển thuốc nhuộm, đều xuất bản năm 2011, được xây dựng từ tài liệu lưu trữ tại Poznań và Wrocław cùng giấy tờ của Marie ở New York.

Một lọ bị mốc và một người Nga may mắn

Dmitri Romanowsky học y tại Học viện Quân y ở St Petersburg và nghiên cứu sốt rét trong phần lớn sự nghiệp. Năm 1890, ông công bố một phương pháp mà trên giấy gần như giống hệt phương pháp của Chęciński: xanh methylen chưa biến đổi và eosin, với lượng eosin nhiều hơn một chút.

Tháng 9 năm 1891, ông công bố phương pháp làm nên tên tuổi mình, và chi tiết quan trọng lại nằm khuất trong phần hướng dẫn. Kết quả tốt nhất của ông đến từ die vorräthige Methylenlösung, một dung dịch xanh methylen dự trữ đã để hơn hai tháng và có nấm mốc mọc trên đó. Nấm mốc và thời gian lưu trữ đã làm thuốc nhuộm bị khử methyl một phần. Romanowsky không biết điều đó và không thể kiểm soát nó, còn những người khác thử phương pháp của ông thì không tạo được màu tím. Luận án của ông đã được nộp tại St Petersburg vào tháng 6 năm 1891, vì vậy cách kể thông thường coi 1891 là năm phát hiện.

Buổi trình diễn của Malachowski diễn ra vào tháng 6 năm 1890, sớm hơn hơn một năm, và phương pháp của ông tạo ra kết quả một cách có chủ đích.

Vì sao thuốc nhuộm lại mang tên nhầm người

Kristine Krafts, Ernst Hempelmann và Barbara Oleksyn đã tập hợp lập luận ủng hộ Malachowski, dựa trên bốn điểm. Ngày trình diễn công khai: tháng 6 năm 1890 so với tháng 9 năm 1891. Từ có chủ đích so với từ tình cờ. Việc Malachowski công bố phương pháp đầy đủ, kể cả borax, trong khi phương pháp của Romanowsky phụ thuộc vào một biến số không được kiểm soát. Và nhận xét rằng mô tả về nhân ký sinh trùng sốt rét, cùng màu tím giúp nhìn thấy nó, gần như biến mất khỏi y văn trong bảy năm vì không ai tái lập được phiên bản tình cờ ấy.

Họ đưa ra kết luận rất thẳng thắn. Trong bài viết tiểu sử, họ gọi việc ghi nhận công lao này là "một sự sai lệch trắng trợn", và trích lời Ralph Lillie, người đã viết năm 1978 rằng "có lẽ chúng ta nên gọi họ thuốc nhuộm này là thuốc nhuộm Malachowski".

Nhận định đó bị phản bác, như thường thấy trong các tranh luận về quyền ưu tiên, và bản chất cuộc tranh luận đáng được giải thích hơn là phân xử. Một lập luận về quyền ưu tiên phải xác định phát hiện ấy là gì. Nếu phát hiện là màu tím, Malachowski có buổi trình diễn được ghi lại sớm hơn. Nếu phát hiện là phương pháp được công bố, cả hai người đều công bố năm 1891 và thuốc nhuộm được đặt theo tên Romanowsky. Nếu phát hiện là lời giải thích, không ai trong hai người có thể nhận công, vì không ai biết quá trình làm thuốc nhuộm biến đổi theo thời gian là sự khử methyl, và không ai giải thích được vì sao màu ấy xuất hiện. Điểm cuối này thường bị bỏ qua trong các bài kể phổ thông. Thành phần tạo hiệu ứng là một tạp chất chưa ai xác định, và người đầu tiên chủ động tạo ra màu ấy đã làm được nhờ một công thức thực nghiệm có thể tái lập, chứ không phải nhờ hiểu công thức đó tác động như thế nào.

Hai bài báo năm 2011 là những trình bày được công bố đầy đủ nhất về lập luận ủng hộ Malachowski, và cả hai đều có thể đọc miễn phí tại PubMed: bài tổng quan dài tại PMID 21235291 và bài viết tiểu sử tại PMID 21660627. Hồ sơ PubMed của bài tổng quan cũng liệt kê một bài bình luận về nó, đăng trên cùng tạp chí vào cuối năm đó tại 86(5):366, nhắc nhở một cách xác đáng rằng lập luận này đã bị phản bác trên ấn phẩm ngay khi xuất hiện.

Tranh chấp này không phải bất đồng về hóa học. Tất cả những người liên quan đều đồng ý về bản chất của màu tím và những thành phần tạo ra nó. Bất đồng nằm ở việc ai đạt được kết quả trước, và liệu một kết quả tình cờ mà không ai tái lập được có được tính là đã đạt tới đích hay không.

Những đóng góp gắn với các tên tuổi về sau

Nếu Malachowski tạo ra màu tím trước, vì sao thuốc nhuộm lại mang tên Romanowsky, Wright và Giemsa?

Bởi một thuốc nhuộm chỉ hoạt động thành công một lần trong tay người phát minh chưa thể được coi là một thuốc thử. Công trình về sau đã biến một hỗn hợp thất thường thành thứ mà một kỹ thuật viên ở quốc gia khác có thể dùng vào một ngày thứ Ba bình thường.

Nocht đạt được điều đó bằng suy luận. Sau khi không thu được kết quả ổn định từ một thuốc nhuộm trung tính đơn giản, ông kết luận rằng màu tím phải đến từ một chất có trong xanh methylen nhưng không phải xanh methylen, rồi bắt đầu tìm kiếm nó. Unna trước đó đã nhận thấy dung dịch xanh methylen để lâu nhuộm các hạt của dưỡng bào thành màu đỏ, và đề xuất rằng một chất mới hình thành khi thuốc nhuộm biến đổi theo thời gian. Bernthsen đã chứng minh vào năm 1885 rằng môi trường kiềm tách các nhóm methyl khỏi xanh methylen, và những sản phẩm này chính là các chất mà ngày nay chúng ta gọi là azure. Nocht chiết phân đoạn tạo hiệu ứng bằng chloroform và chỉ có thể gọi nó là Rot aus Methylenblau, chất đỏ từ xanh methylen; Michaelis đặt tên cho nó là azure I vào năm 1901. Jenner giải quyết khâu thao tác. Hòa tan lại kết tủa xanh methylen và eosin trong methanol tuyệt đối tạo ra một dung dịch ổn định duy nhất, vừa cố định vừa nhuộm tiêu bản, và loại bỏ bước cố định bằng nhiệt. Leishman và Reuter kết hợp thuốc nhuộm đa sắc với dung môi cồn, đạt được cả độ ổn định lẫn màu tím. Wright thay bước ủ mười hai giờ ở 65 °C và để yên mười ngày bằng một giờ trong dòng hơi nước. Giemsa hoàn toàn ngừng dựa vào dung dịch biến đổi ngẫu nhiên theo thời gian, thay vào đó dùng lượng đã định của các thuốc nhuộm đã biết cùng glycerol trong methanol để sản phẩm chịu được khí nóng nhiệt đới. Ông không bao giờ công bố cách tạo methylen azure tinh khiết. Ông bán nó cho phòng thí nghiệm của Tiến sĩ Grübler ở Leipzig, nơi tiếp thị nó dưới tên azure I và tuyên bố rằng chỉ phiên bản của họ mới là thuốc nhuộm Giemsa đích thực.

Bản chất của chất azure đó vẫn còn được tranh luận. Một số người cho rằng nó đơn giản là xanh methylen đa sắc, số khác cho rằng nó giàu azure B. Câu trả lời xuất hiện từ một cuộc chiến. Khi không thể mua được thuốc nhuộm Đức, một nhóm thuộc Cơ quan Y tế Công cộng Hoa Kỳ, gồm Ralph Lillie cùng Maurice Roe và Aimee Wilcox, phát hiện rằng kết quả nhuộm tốt nhất đến từ ba thành phần được tách riêng: xanh methylen chưa biến đổi, sản phẩm phân hủy do khử methyl của nó là azure B, và eosin. Azure B thay thế azure I không còn mua được, và ba thành phần này vẫn là nền tảng của thuốc nhuộm dùng để chẩn đoán sốt rét ngày nay.

Cơ chế hóa học của sự tương tác giữa ba thành phần này trên lam kính là một câu hỏi riêng, được trình bày ở một trang khác. Bài vai trò của thuốc nhuộm và hóa học của các thuốc nhuộm kiểu Romanowsky giải thích azure B và eosin mỗi chất làm gì, và vì sao cặp chất này tạo ra một màu mà từng chất riêng lẻ không tạo được. Trang ứng dụng trong hiển vi và phòng thí nghiệm đề cập đến khía cạnh thực hành: một tiêu bản cụ thể cho thấy những gì, và cách đánh giá liệu một sản phẩm có phù hợp với phương pháp bạn định sử dụng hay không.

Phần lịch sử vẫn còn mang tính thời sự

Có một chi tiết trong câu chuyện này không hết đúng vào năm 1902. Trong khoảng năm mươi năm, thành phần quan trọng nhất của thuốc nhuộm sốt rét tiêu chuẩn trên thế giới là một tạp chất chưa có tên. Nó xuất hiện tình cờ, lượng của nó thay đổi giữa các lọ, danh tính của nó là bí mật thương mại trong một phần thời gian đó, và tỷ lệ của nó vẫn được tranh luận cho đến những năm 1940. Những người dùng thuốc nhuộm không hề cẩu thả. Họ không có cách nào biết trong lọ có gì.

Phiên bản hiện đại của cùng vấn đề này là một bộ tiêu chuẩn chất lượng chỉ mô tả một phần của vật liệu. Đáp ứng USP là con đường đạt tới độ tinh khiết cao nhất mà thị trường cung cấp, vì đây là một tiêu chuẩn được công bố đầy đủ chứ không phải một phép đo đơn lẻ: định tính, độ tinh khiết, tạp chất hữu cơ bao gồm các thuốc nhuộm azure, dung môi tồn dư, tạp chất nguyên tố, cặn sau nung, giới hạn vi sinh vật và nội độc tố vi khuẩn. Blupreme lấy xanh methylen từ một nhà sản xuất dược phẩm và công bố đầy đủ phiếu kiểm nghiệm, để từng mục trong danh sách đó đều có thể được kiểm chứng thay vì chỉ được khẳng định. Một phiếu kiểm nghiệm chỉ báo cáo kết quả kim loại nặng rồi gọi đó là tuân thủ USP chính là phiên bản ngày nay của một lọ mang nhãn "xanh methylen đã được làm biến đổi": có thể là một thuốc thử tốt, nhưng nhãn không cho bạn biết bên trong có gì.