Чому поглинання метиленового синього змінюється з концентрацією

Візьміть одну пляшку вихідного розчину метиленового синього й налийте його у дві склянки. Першу наповніть вихідним розчином, а другу — розчином, розведеним у десять разів. Друга склянка, як і очікується, світліша. Придивіться — змінилося ще дещо. Змінився відтінок. Один розчин ближчий до чистого небесно-блакитного, а інший — до синього з фіолетовим відтінком. Розведення не просто зменшило інтенсивність. Воно змінило те, яка хімічна форма забезпечує основну частину поглинання.

Причина цього зсуву проста. Розчинений метиленовий синій — це не одна хімічна форма. Окремий катіон барвника, який називають мономером, може укладатися площиною до площини з другим катіоном, утворюючи димер, а димери можуть об’єднуватися у більші агрегати. Кожна форма має власний спектр поглинання. Показання спектрофотометра — це сумарне поглинання суміші, наявної в цій кюветі за цих умов. Змініть склад суміші — і спектр зміниться, навіть якщо загальний вміст барвника точно відповідає коефіцієнту розведення.

Мономер і димер поглинають по-різному

Уявіть мономер як пласку картку з позитивним зарядом, розподіленим по її системі кілець. Дві такі картки можуть лежати площиною до площини. Позитивні заряди відштовхуються, але пласкі ароматичні поверхні притягуються завдяки стекінговим взаємодіям, а навколишня вода та протиіони екранують відштовхування. У результаті утворюється зв’язана пара зі спільними електронними станами. Її дозволені переходи мають вищу енергію, ніж перехід мономера, тому смуга димера з’являється на коротшій довжині хвилі, ніж смуга мономера, а більші агрегати додають плече ще далі в синій частині спектра.

За дуже низької концентрації в чистій воді переважають мономери, і домінує довгохвильова смуга. Зі зростанням загальної концентрації частка парної форми збільшується, а короткохвильова смуга зростає відносно першої. Отже, співвідношення двох смуг відображає склад суміші, а не безпосередньо загальну концентрацію. Вимірювання на одній довжині хвилі не дає змоги розрізнити ці дві форми без припущення про те, яка з них присутня.

Саме тому довідкові спектри завжди мають супроводжуватися умовами вимірювання. У спектральному довіднику для метиленового синього положення смуг наведено разом із розчинником, сольовим фоном, pH, температурою та діапазоном концентрацій, за яких їх отримано. Якщо навести положення піка без цих умов, число буде недостатньо визначеним. Дві лабораторії можуть отримати різні спектри того самого барвника й обидві мати рацію, бо вони вимірювали різні суміші.

Що зміщує рівновагу

Концентрація — головний чинник. Для утворення димера потрібно, щоб зустрілися два мономери, тому його частка зростає швидше, ніж лінійно, зі збільшенням загального вмісту барвника. Опубліковані константи димеризації у воді поблизу кімнатної температури становлять тисячі обернених молярних одиниць, тому частка димера різко зростає в мікромолярному діапазоні. Глобальне моделювання даних у широкому діапазоні концентрацій барвника — від мікромолярних до мілімолярних — виявило ненульовий внесок тетрамера вже нижче 34 мікромолярів. Це застерігає від довіри до суто двокомпонентної моделі за концентрацій у десятки мікромолярів. Точні частки залежать від середовища, тому ця стаття описує напрямки змін, а не пропонує універсальну таблицю перерахунку.

Сіль — другий чинник. Розчинені іони екранують відштовхування між двома катіонами, тому додавання хлориду натрію та подібних електролітів зміщує склад суміші в бік димерів і агрегатів за тієї самої концентрації барвника. Цей ефект видно в дослідженнях агрегації метиленового синього в сольових і водних середовищах, де барвник у концентраціях приблизно від 1 мікромоляра до 3.4 мілімоляра вимірювали за концентрацій хлориду натрію від 0 до 0.15 моляра. У цій моделі частка тетрамера сягала приблизно 0.93 за одночасно високих концентрацій барвника й солі. Отже, спектр, записаний у воді, і спектр, записаний у фізіологічному розчині, не є взаємозамінними еталонами.

Температура діє у протилежному напрямку. Стекінг вивільняє зв’язану воду, а тепловий рух протидіє йому, тому нагрівання розчину зазвичай спричиняє дисоціацію частини димерів назад на мономери, тоді як охолодження сприяє асоціації. Визначена за моделлю ентальпія дисоціації від’ємна, приблизно мінус 30 кілоджоулів на моль у діапазоні від 282 до 333 кельвінів, що підтверджує екзотермічну асоціацію. Холодний зразок, виміряний одразу після зберігання в холодильнику, може виглядати більш агрегованим, ніж той самий зразок після встановлення рівноваги за кімнатної температури.

Розчинник задає вихідні умови. Вода завдяки сильному гідрофобному ефекту сприяє стекінгу пласких катіонів барвника. Спирти, як-от етанол і метанол, краще сольватують кільця та руйнують агрегати, тому за тієї самої концентрації барвника в етанолі мономерний характер виражений сильніше, ніж у воді. Апротонні співрозчинники діють так само: у сумішах води та DMSO за 293 кельвінів додавання DMSO пригнічувало димеризацію, що вказує на структуру води як рушійний чинник стекінгу. З поверхнево-активними речовинами слід бути обережними, оскільки їхня дія може бути протилежною. Вище критичної концентрації міцелоутворення міцели можуть солюбілізувати окремі мономери й відновлювати спектр, подібний до мономерного. Нижче цього порога протилежно заряджена поверхнево-активна речовина натомість може сприяти стекінгу: за концентрації барвника 100 мікромолярів полімеризація, спричинена SDS, досягала максимуму поблизу 4 мілімолярів SDS, приблизно за половини концентрації міцелоутворення, після чого за вищого вмісту поверхнево-активної речовини відбувався перерозподіл. Праця про вплив взаємодій барвника з розчинником та організованих середовищ на спектри метиленового синього показує, наскільки сильно спостережувані смуги визначає безпосереднє молекулярне оточення, а не лише загальна концентрація.

pH має значення переважно за крайніх значень. У близькому до нейтрального діапазоні, який використовують у більшості лабораторних робіт, метиленовий синій залишається у своїй звичній синій катіонній формі, а спектральні зміни визначає переважно агрегація. Сильна кислота чи основа, окисно-відновні реакції з утворенням безбарвної лейкоформи або зв’язування з білками та частинками додають стани поза парою мономер–димер. Якщо спектр змінюється після додавання буфера, перевірте його склад на наявність солей і компонентів, здатних до зв’язування, перш ніж приписувати все лише pH. Довідник із хімії та протонування розглядає ці питання хімічної ідентичності окремо від питання агрегації, якому присвячено цю статтю.

Чому пряма закону Бугера — Ламберта — Бера викривляється

Закон Бугера — Ламберта — Бера стверджує, що оптична густина дорівнює добутку коефіцієнта поглинання, концентрації та довжини оптичного шляху. Це закон підрахунку. Він передбачає, що об’єкти, які підраховують, залишаються незмінними зі зміною їхньої кількості: одна поглинальна форма, незмінний спектр, відсутність хімічних змін зі зміною концентрації, монохроматичне зондуюче світло, відсутність розсіювання чи повторного випромінювання, а також світло, яке справді проходить заявлений шлях.

Агрегація порушує перше припущення. Формально загальна оптична густина залишається сумою внесків усіх форм: довжина оптичного шляху, помножена на коефіцієнт поглинання кожної форми та її власну концентрацію. Кожна форма підкоряється закону. Суміш — ні, оскільки концентрації окремих форм є нелінійними функціями загальної концентрації барвника. Тому калібрувальна крива оптичної густини на смузі мономера залежно від загальної концентрації барвника спочатку пряма в сильно розведених розчинах, а зі зростанням концентрації вигинається вниз, бо кожна додаткова порція містить пропорційно менше мономера. Крива, побудована за смугою димера, вигинається в інший бік. Дослідження агрегації вказують саме на цей механізм як джерело спостережуваних відхилень від закону Бугера — Ламберта — Бера. Типова помилка — провести пряму через викривлену ділянку та екстраполювати її. Пряма дійсна лише в тому діапазоні й тій матриці, для яких її побудовано.

Розведення створює споріднену пастку. Розведення концентрованого вихідного розчину до робочого діапазону приладу не зберігає співвідношення хімічних форм. У розведеному розчині в кюветі рівновага зміщується в бік мономера, тому його спектр правильно описує розведений зразок, але неправильно — вихідний розчин. Зворотний розрахунок спектра вихідного розчину шляхом пропорційного збільшення оптичної густини дає коректну оцінку загального вмісту лише тоді, коли калібрування вже враховує цей зсув. Він ніколи не відновлює початкової форми смуг. Порівнюючи спектр концентрату з розведеним еталоном, ви порівнюєте дві різні суміші.

Довжина оптичного шляху — частина результату

Оптична густина пропорційна відстані, яку світло проходить крізь зразок. Кювета 10 mm дає вдесятеро більшу оптичну густину, ніж кювета 1 mm з тим самим розчином. Це масштабування точне лише для того самого розчину, а через агрегацію це уточнення стає принциповим.

На практиці довжина оптичного шляху — інструмент для збереження вимірювань у допустимому діапазоні. Довгий шлях забезпечує чутливість для розведених, переважно мономерних розчинів. Короткий шлях дає змогу виміряти концентрований зразок у межах шкали без значного розведення, яке змінило б рівновагу. У дослідженні агрегації, з якого взято наведені вище числа, застосовували саме такий підхід: кювети 1 сантиметр для концентрацій барвника від 1.1 до 34 мікромолярів і кювети 0.01 сантиметра для концентрацій від 94 мікромолярів до 3.4 мілімоляра. Платформи для мікрооб’ємних вимірювань і планшетні зчитувачі додають власні геометричні особливості: короткі, іноді змінні оптичні шляхи та поверхні, на яких катіонний барвник може адсорбуватися. Наводьте довжину шляху разом із числовим результатом так само, як спектральний довідник наводить розчинник і сіль. Оптична густина без довжини шляху — не результат. Це чутка.

Вимоги до вимірювань випливають із механізму. Перед вимірюванням дайте зразкам досягти рівноваги за однакової температури. Використовуйте кювети одного типу в однаковій орієнтації, відповідні холості проби з тим самим сольовим і буферним фоном та чистий посуд, оскільки метиленовий синій адсорбується на склі й пластику, а забарвлена кювета зберігає пам’ять про попередній концентрований зразок. Коли кінетика агрегації має значення, проводьте вимірювання невдовзі після приготування. Кожну калібрувальну криву будуйте в тій самій матриці та за тієї самої довжини оптичного шляху, що й для невідомих зразків. Для візуальних перевірок пам’ятайте: око — поганий спектрометр. Чи можна визначити чистоту за кольором розчину — окреме питання з негативною відповіддю, і зміни відтінку через агрегацію є однією з причин.

Схема, яку варто тримати біля приладу

Наведений нижче рисунок стисло передає зміст статті як довідкову схему для лабораторного столу. Три розчини містять той самий барвник, але відрізняються загальною концентрацією та сольовим фоном. Їхні схематичні спектри показують, як зі зростанням стекінгу внесок довгохвильової смуги мономера зменшується на користь короткохвильової смуги димера. Умови зазначено на рисунку, оскільки без них ці криві не можна використовувати повторно. Виміряні положення смуг за зазначених умов шукайте у спектральному довіднику. Про те, як розчинений барвник потрапляє в клітини, читайте в матеріалі про надходження в клітини через відновлення та розподіл між середовищами. Про те, як доза світла та геометрія додатково впливають на результати фотохімічних вимірювань, читайте в матеріалі про світлову експозицію та геометрію вимірювання.

Основне правило складається з двох частин. Спектр визначає склад суміші, наявної в кюветі за зазначених умов. Лише калібрування, побудоване за тих самих умов, перетворює оптичну густину на загальну концентрацію.