Метиленовий синій при ушкодженні мозку: як розуміти доклінічні докази

Удар по голові, закупорена артерія та повільне нейродегенеративне захворювання можуть зрештою призвести до тієї самої проблеми: мозку більше не вистачає енергії для роботи. Саме цей спільний наслідок пояснює, чому одна й та сама сполука постійно з’являється в науковій літературі з усіх трьох напрямів. Але спільний наслідок не означає спільної концепції. Введення засобу до ушкодження, протягом години після нього та оцінювання його ефекту через місяці перевіряють різні ідеї, навіть якщо шприц містить ту саму синю рідину.

Ця стаття присвячена тій частині літератури, що стосується ушкоджень. Вона розглядає, що означає застосування метиленового синього при ушкодженні мозку в експериментах на тваринах, відокремлює травматичне ушкодження від інсульту та хронічної нейродегенерації й показує, чому час введення дози пояснює більшість відмінностей між дослідженнями.

Три ушкодження, один енергетичний збій

Механізм, що поєднує ці моделі, міститься всередині мітохондрій. У нормі електрони проходять електрон-транспортним ланцюгом для утворення АТФ, а справний ланцюг стримує утворення активних форм кисню. Після ушкодження окремі ланки ланцюга дають збій, вироблення АТФ знижується, а утворення вільних радикалів зростає. Огляд у Molecular Neurobiology за 2018 рік описує метиленовий синій як альтернативний переносник електронів: він приймає електрони від NADH і передає їх цитохрому c, що підвищує активність комплексу IV та відновлює синтез АТФ навіть за порушення роботи початкової частини ланцюга.

Наведені числові дані конкретні. У препаратах клітин і зрізів тканини активність комплексу IV зростала на 30–100 відсотків, а споживання кисню збільшувалося відповідно. Це вказує, що додаткові електрони виконували корисну роботу, а не витікали з утворенням радикалів. У щурячій моделі інсульту вироблення АТФ в ураженій ділянці через 24 години після введення було приблизно на 30 відсотків вищим, ніж у тварин без лікування. Огляд у Biochemistry (Moscow) за 2022 рік додає подальші наслідки: менший окиснювальний стрес, слабше нейрозапалення, менше апоптозу, а також вплив на моноаміноксидазу, синтазу оксиду азоту, біогенез мітохондрій, аутофагію та агрегацію неправильно згорнутих білків.

Отже, концепція проста. Ушкодження перекриває звичайний шлях електронів, а метиленовий синій пропонує обхідний. Усе подальше залежить від того, яке саме ушкодження досліджують, коли вводять засіб і як вимірюють результат.

Травматичне ушкодження — не інсульт

У моделі черепно-мозкової травми сила діє одномоментно. Первинне ушкодження є механічним: тканина розривається, судини лопаються, а проникність гематоенцефалічного бар’єра зростає протягом хвилин. Метиленовий синій потенційно може впливати на вторинну хвилю, що розгортається протягом годин і днів: мітохондрії в тканині, яка вижила, втрачають функцію, запалення поширюється, а набряк наростає. Кінцеві показники в цих дослідженнях відображають цю послідовність: об’єм осередку ураження, вміст води в мозку, виживання нейронів поблизу місця удару та пізніші поведінкові показники, як-от відновлення рухових функцій або навчання в лабіринті.

У моделі інсульту або глобальної ішемії ушкодження розвивається інакше. Кровотік припиняється, протягом хвилин настає енергетичний збій, а відновлення кровотоку спричиняє окреме реперфузійне ушкодження. Тут введення препарату прив’язане до судинної події, часто відбувається протягом хвилин після оклюзії або реперфузії, а кінцеві показники кількісно відображають гострі зміни стану тканини протягом годин або одного-двох днів: розмір інфаркту, кровотік і раннє функціональне відновлення. Один із підходів у літературі про інсульт — попереднє введення препарату тваринам до оклюзії судини. Так перевіряють профілактику способом, який жоден експеримент із травмою голови не може етично відтворити на людях.

Результати досліджень інсульту найпереконливіші в літературі про ушкодження, і серед них є найчіткіший випадок відсутності ефекту. У щурів, яким вводили метиленовий синій під час реперфузії після одногодинної оклюзії середньої мозкової артерії, на 2-й день інфаркти були на 30 відсотків меншими, зі збереженням більшої частини тканини під загрозою в ядрі та пенумбрі (Shen, 2013). Дослідження з постійною оклюзією виявило повільніший перехід тканини під загрозою до інфаркту, але не зменшення остаточного об’єму інфаркту через 24 години за жодної з двох досліджених доз (Rodriguez, 2014). Третє дослідження оклюзії показало зменшення розміру інфаркту приблизно вдвічі при середній дозі та безпосередньо задокументувало ультраструктуру мітохондрій і мітофагію в ішемізованому мозку. Водночас автори повідомили про неочікувану деталь: вимірюваний апоптоз зростав, тоді як некроз зменшувався (Di, 2015). А при глобальній ішемії безперервна інфузія низької дози відновлювала активність цитохром-c-оксидази, рівні АТФ і потенціал мітохондріальної мембрани у вразливій ділянці CA1 гіпокампа, зберігала її нейрони та захищала просторову пам’ять (Lu, 2016). На цьому вимірюванні в CA1 варто зупинитися: це прямі дані про АТФ і дихальний ланцюг усередині ушкодженого мозку, тоді як у літературі про ЧМТ про ці зміни переважно роблять висновки, а не вимірюють їх.

Хронічна нейродегенерація відрізняється від обох випадків. У моделях хвороб Альцгеймера, Паркінсона та Гантінгтона тваринам вводять препарат протягом тижнів або місяців і вимірюють агрегацію білків, обмін дофаміну чи поступове зниження когнітивних функцій. Ці кінцеві показники майже не мають нічого спільного з осередком ураження, виміряним через кілька днів після удару. Читачі, які переносять результат з однієї категорії до іншої, переносять висновок через межу, якої самі експерименти ніколи не перетинали. Наш посібник із літератури про нейродегенерацію розглядає ці тривалі дослідження в їхньому власному контексті, а порівняння з доказами лише щодо інсульту докладно відокремлює експерименти із закупоренням судин від експериментів з ударом.

Що насправді робили в моделях ЧМТ

Жодного дослідження метиленового синього при черепно-мозковій травмі за участю людей не опубліковано. Усі дані щодо ЧМТ отримано на тваринах, переважно щурах і мишах, і вони зосереджені навколо невеликої кількості експериментів, які варто назвати, адже їхні деталі відрізняються так, як цього не видно в узагальнених викладах.

У найпершому дослідженні з контрольованим ударом по корі щурам внутрішньовенно вводили 1 mg/kg через одну годину після легкого удару, а потім 0.5 mg/kg через три години (Watts, 2014). Об’єм осередку ураження за даними МРТ залишався меншим у тварин, які отримували препарат, протягом двох тижнів спостереження. Кількість помилкових постановок лап у тесті ходьби значуще знижувалася на 1-й, 2-й і 7-й день, але не на 14-й. При мікроскопічному дослідженні на 14-й день кількість нейронів із дегенеративними змінами в ушкодженій корі становила 270 проти 368 на поле зору, а кількість нейронів з аномальним забарвленням за Нісслем — 41 проти 73. Іншими словами, ранній захист, але зі згасанням переваги за поведінковими показниками до другого тижня.

У дослідженні дифузного ушкодження використовували серединну рідинну перкусію в мишей та одноразову внутрішньовенну дозу 2 mg/kg протягом пів години (Fenn, 2015). У тварин, які отримували препарат, спостерігали менш виражену експресію генів запалення, менше мікроглії із запальним фенотипом, менш виражені ознаки набряку та відсутність депресивноподібної поведінки на 7-й день. Відсутність ефекту в інших показниках не менш важлива: саме ушкодження лише помірно підвищувало вміст води в мозку, а метиленовий синій не усував втрату маси тіла чи дефіцит рухової координації. Протизапальний ефект не означає повного захисту.

Два дослідження на мишах використовували однакову схему: 1 mg/kg через одну годину, 0.5 mg/kg через шість годин, а потім щоденне введення протягом трьох днів — і розширили розуміння механізму. У моделі удару по корі введення препарату зменшувало об’єм осередку ураження через 24 години, 72 години та на 14-й день, водночас зберігаючи нейрони й підвищуючи маркери аутофагії (Zhao, 2016). У моделі рідинної перкусії воно зменшувало апоптоз нейронів, знижувало підвищену проникність гематоенцефалічного бар’єра та поліпшувало неврологічні показники протягом двох тижнів (Shen, 2019). Проте вміст води в мозку не відрізнявся через 72 години в дослідженні Zhao, а результати тесту на ротароді — на 1-й і 3-й день у дослідженні Shen. Показники осередку ураження та виживання клітин змінювалися; набряк і ранні рухові показники не завжди змінювалися разом із ними.

Щодо часу введення особливо вирізняється експеримент із відкладеним введенням (Watts, 2016). У тій самій моделі удару першу дозу вводили лише через 24 години після ушкодження. На 2-й день у групі з відкладеним введенням спостерігали зменшення осередку ураження, зіставне з результатами у тварин, які отримали препарат у перші години, і це зменшення зберігалося на 7-й та 14-й день. Поведінковий сигнал був слабшим: поліпшення за кількістю помилкових постановок лап у групі з відкладеним введенням було статистично незначущою тенденцією. Одна лабораторія, одна модель, одне 24-годинне вікно. Це справжній доказ того, що вікно виходить за межі перших годин, але водночас це всі наявні докази на користь цього припущення. Зверніть увагу на пастку в слові «відкладений» в інших роботах: у російській серії досліджень, назви яких стосувалися відстроченої нейропротекції, препарат вводили через 30 хвилин, а «відстрочена» означало тривалі результати, а не пізній початок введення.

Менше дослідження осередкового ушкодження на щурах доповнює картину часу введення з іншого боку: і введення безпосередньо перед ушкодженням, і введення через 30 хвилин після нього зменшували порушення функції кінцівок (Stelmashook, 2019). Попереднє введення працює в лабораторії саме тому, що лабораторія планує момент ушкодження.

Тут важливе суворе врахування дози. Огляди описують низькі дози як такі, що стимулюють мітохондріальне дихання, а високі — як такі, що його пригнічують. Це та сама двофазна залежність, яку спостерігають у фармакології метиленового синього загалом. Саме тому результати не можна тлумачити як «більше синього — краще відновлення». Кожне дослідження перевіряє одну точку на кривій. Пояснення залежності «доза — відповідь» простежує цю криву в різних моделях, а профіль безпеки та побічних ефектів розглядає, що натомість відбувається при вищих дозах.

Погляньте на цю таблицю в цілому: та сама сполука, три різні часові шкали. Профілактика стосується середнього рядка, негайне лікування — перших двох, а віддалені результати — першого й третього.

Профілактика, негайне лікування, віддалені результати

Твердження про профілактику найпростіше зрозуміти неправильно. У моделях ішемії тварини, яким вводять препарат до оклюзії судини, мають кращі результати, і це іноді цитують так, ніби метиленовий синій захищає будь-який мозок від будь-якого майбутнього ушкодження. Цього результат не показує. Він показує, що мітохондрії, заздалегідь підготовлені альтернативним шляхом перенесення електронів, краще переносять заплановане припинення кровотоку. Ніхто не планує травму голови.

Негайне лікування — це напрям, у якому зосереджені докази щодо ЧМТ. Введення протягом годин після удару спрямоване на каскад вторинного ушкодження, поки він ще розгортається: енергетичний збій, окиснювальний стрес, запалення, набряк. Поліпшення показників осередку ураження та набряку тут є справжніми ефектами лікування, але це вплив на процес, а не відновлення розірваної тканини.

Віддалені результати — третя концепція. Поведінка, виміряна через тижні після ушкодження, або обмін білків, виміряний через місяці в дегенеративній моделі, дають відповідь на запитання, чи зберігся ранній захист або чи змінили свій перебіг повільні процеси. Менший осередок ураження через 24 години, статистично незначуща поведінкова тенденція після введення дози із затримкою на 24 години та поліпшення результатів у лабіринті через місяці тривалого введення — це три різні твердження з трьома різними вимогами до доказовості. Наразі лише перше підтверджувалося більше ніж один раз.

Чого ці докази не можуть показати

Кожен наведений вище результат має те саме обмеження. Мітохондрії гризунів реагують на метиленовий синій у спосіб, який може бути властивий і людським мітохондріям, але щур, якому внутрішньовенно вводять дозу через кілька хвилин після точно дозованого удару, — не людина, яка потрапляє до відділення невідкладної допомоги через кілька годин після падіння. Анестезія, контрольована тяжкість ушкодження, молоді здорові тварини та коротке спостереження обмежують можливість перенесення результатів. Досліджень метиленового синього при вибуховій травмі взагалі немає, тож тип ушкодження, найактуальніший для військових читачів, має найменше доказів.

Тут також немає підстав переносити дози на людей. У дослідженнях на тваринах використовують внутрішньовенний і внутрішньочеревний шляхи введення в дозах, обраних для контролю експерименту, а не краплі для перорального застосування, які продають у роздріб. Жодне з цих досліджень не встановлює схеми застосування для людини, і жодне не перевіряє метиленовий синій разом зі стандартною допомогою при травмі голови.

Тож чесний підсумок уміщується в один абзац. У гризунів метиленовий синій, введений приблизно в момент травматичного або ішемічного ушкодження мозку, зберігає вироблення енергії мітохондріями, а за цим збереженням спостерігаються менші осередки ураження та кращі показники відновлення. В одному дослідженні ударного ушкодження частина ефекту щодо осередку ураження зберігалася при відкладенні першої дози на 24 години. Чи відбувається щось із цього в ушкодженому мозку людини, не перевірено, а дослідження ЧМТ та інсульту перевіряють різні часові підходи за різними кінцевими показниками. Кожен, хто продає впевненість на основі цих доказів, додає складник, якого в експериментах ніколи не було.