Метиленовий синій, тау та амілоїд: чому механізми видалення білків різняться

Запитайте, що метиленовий синій робить із білками, пов’язаними з хворобою Альцгеймера, — і почуєте одну впевнену відповідь там, де мали б почути три відповіді із застереженнями. У пробірці він перешкоджає злипанню тау. В одній мишачій моделі він знижує рівень розчинного амілоїду, не змінюючи тау. В іншій — пригнічує фермент, який утворює амілоїд. Кожен із цих результатів реальний. Жоден не розкриває всієї картини, і не всі вони спостерігаються в однієї тварини одночасно. Ця стаття розмежовує ці три результати, щоб висновок з одного експерименту перестали цитувати як доказ результату іншого.

Читачам, які хочуть ширше зрозуміти, як метиленовий синій діє всередині клітин, варто почати з відповідної статті. Тим, хто хоче знати, чи допомогло щось із цього пацієнтам, слід прочитати огляд клінічних даних щодо хвороби Альцгеймера, де й мають розглядатися результати випробувань за участю людей. Ця стаття не повторює той огляд.

Результат щодо тау стосується дослідів з агрегації

Найдавніша з трьох історій походить із безклітинних досліджень тау — білка, який утворює нейрофібрилярні клубки. У досліді зі зв’язування тау з тау фрагменти цього білка об’єднуються в парні спіральні філаменти, а фенотіазинові барвники, зокрема метиленовий синій, блокують це об’єднання за низьких мікромолярних концентрацій. Пізніші біохімічні дослідження дали цьому хімічне пояснення: барвник окиснює залишки цистеїну в тау, що стабілізує мономерну форму та пригнічує утворення фібрил, які інакше зростали б. За опублікованими даними, концентрації, що пригнічують агрегацію тау, становлять приблизно від одиниць до перших десятків мікромолів на літр — цей діапазон важливий для всього, про що йтиметься далі.

Зверніть увагу, що саме тут стверджується. Це нічого не говорить про утворення тау, його фосфорилювання в живому мозку чи видалення. Йдеться про те, що за визначених умов у пробірці окиснений барвник не дає молекулам тау об’єднуватися. Це точний, вузький і корисний результат. Проблеми починаються, коли його розширюють до загального твердження, що метиленовий синій усуває патологію тау, адже дані досліджень на тваринах не узгоджуються з такою версією.

Результат щодо протеасоми стосується мишей 3xTg-AD і показує розбіжність між амілоїдом і тау

Найчіткіший експеримент із розбіжними кінцевими показниками — це 16-тижневе дослідження з додаванням речовини до корму мишей із трьома мутаціями, пов’язаними з хворобою Альцгеймера. Починаючи із шестимісячного віку, тварини їли корм із метиленовим синім, а дослідники одночасно вимірювали три показники: активність протеасоми, рівні амілоїду та тау.

Активність протеасоми змінилася. Хімотрипсиноподібна активність зросла приблизно на чверть, а трипсиноподібна — приблизно наполовину, тоді як третя каталітична активність істотно не змінилася. Рівні розчинного амілоїду-бета 40 і 42 знизилися приблизно на чверть кожен. Автори витлумачили це як посилене видалення, а не зменшення утворення, оскільки білок-попередник і фрагменти його процесингу не змінилися; у контрольній пробі водного лабіринту також покращилися показники навчання та пам’яті.

А далі — розбіжності. Нерозчинний амілоїд не змінився. Забарвлення на бляшки не змінилося. Загальний рівень людського тау та фосфо-тау за треоніном 181 не змінився, як і порушення локалізації тау. Мітохондріальні показники також не змінилися: не було значущого впливу на активність цитохром-c-оксидази, рівень білка цієї оксидази чи ATP. Отже, у цій моделі й за цього режиму введення метиленовий синій підвищив дві з трьох активностей протеасоми, знизив рівень розчинного амілоїду, відновив поведінковий показник і не змінив показників тау, нерозчинного амілоїду та досліджених мітохондріальних показників.

Одне застереження радше уточнює цей висновок, ніж послаблює його. У досліджуваному віці в цих мишей ще не утворилися агрегати тау, тому експеримент не може показати, що метиленовий синій не діє проти клубків тау. Він показує, що рівень розчинного амілоїду може знижуватися без змін вимірюваних показників тау, — саме такий результат, коли один білок змінюється, а інший ні, і потрібен для розуміння цієї теми. Якщо ви вважали, що активація протеасоми метиленовим синім одночасно видаляє обидва характерні білки, це дослідження виправляє таке уявлення.

Результат щодо утворення амілоїду стосується старих мишей PSAPP і суперечить попередньому механізму

Інша група, інша модель і протилежне пояснення початкової ланки процесу. У тримісячному дослідженні з введенням через шлунковий зонд 15-місячним мишам PSAPP щоденна пероральна доза 3 mg/kg зменшила навантаження бляшками в різних ділянках мозку приблизно на третину — половину та знизила рівні кількох фракцій амілоїду, зокрема олігомерів, виміряних окремим спеціалізованим методом. Але тут запропонованим механізмом було зменшення утворення, а не прискорене видалення: рівень білка BACE1 у мозку знизився, рівень його продукту C99 знизився, а рівень матричної РНК — ні. Це вказує на вплив на рівні білка, а не на зниження експресії гена.

Дослідження на клітинах посилили аргументацію. У безклітинному досліді з рекомбінантним ферментом метиленовий синій безпосередньо пригнічував BACE1, а в клітинах яєчника хом’яка, що експресували людський білок-попередник амілоїду, рівні секретованого амілоїду 40 і 42 знижувалися вже за концентрації 1.56 мікромоля на літр, тоді як сам попередник залишався незмінним. Порівняйте це з попереднім дослідженням, де фрагменти процесингу попередника не змінилися, а результат пояснювали видаленням. Обидва результати не можуть описувати один і той самий універсальний механізм, адже моделі, вік, дози, шляхи введення та тривалість різняться. Саме в цьому суть. Вплив метиленового синього на амілоїд в одних експериментальних умовах реалізується через утворення, а в інших — через видалення, і цитування будь-якого з цих результатів без опису умов вводить в оману.

Одна хімія, кілька мішеней: зв’язок через окиснення цистеїну

Третій напрям досліджень пояснює, як одна й та сама окисно-відновна хімія може проявлятися в історіях про різні білки. У біохімічному дослідженні пригнічення каспаз метиленовий синій інактивував каспазу-6, окиснюючи її каталітичний цистеїн до сульфенової кислоти, що підтвердили мас-спектрометрією; концентрація напівмаксимального пригнічення становила близько 10.6 мікромоля на літр. Каспаза-3 пригнічувалася за подібної концентрації. Автори прямо пов’язали це з літературою про тау: та сама хімія окиснення цистеїну, яка, за припущенням, утримує тау в мономерній формі, може інактивувати цистеїнову протеазу, а діапазони ефективних концентрацій перекриваються.

Це витончене пояснення, але водночас і застереження. Окисно-відновно активна молекула, яка окиснює доступні залишки цистеїну, за будь-якої активної концентрації матиме більш ніж одну мішень. Історія про дезагрегацію тау, історія про каспази та, можливо, інші мають спільне хімічне дієслово, але різні іменники. Це спільне дієслово не робить результати взаємозамінними. Воно означає, що доза й контекст визначають, яка мішень важлива, і що тривале введення, спрямоване на один цистеїнзалежний процес, може зачіпати й інші, — автори дослідження каспаз прямо порушили це питання. Пов’язані питання про те, як окисно-відновна хімія метиленового синього визначає його мішені, що активація протеасоми означає для інших агрегованих білків і чи змінює тривале введення профіль мішеней, кожне заслуговують на окремий розгляд.

Механізми за кінцевими показниками: який результат до якої моделі належить

Прочитайте таблицю рядок за рядком — і висновок стане очевидним. Немає жодного рядка, де зміни були б у кожному стовпці. Найпереконливіший результат щодо утворення амілоїду походить із дослідження, у якому протеасому взагалі не досліджували. Найпереконливіший результат щодо протеасоми походить із дослідження, у якому процесинг попередника не змінився. Результат щодо тау переважно стосується пробірок і хімії, спільної з ферментами, які не є цільовими мішенями. Кожен, хто зводить ці стовпці до одного твердження — що метиленовий синій видаляє патологічні білки як клас, — пише огляд експерименту, якого ніколи не проводили.

Така дисципліна поширюється й на пацієнтів. Чи забезпечують ці механізми разом клінічну користь — окреме питання зі своїми випробуваннями та висновками. Відповідь на нього наведено в огляді клінічних доказів щодо хвороби Альцгеймера, а не тут.