Метиленовий синій і розсіяний склероз: що перевіряли в дослідженнях на тваринах

Шукаючи інформацію про метиленовий синій при розсіяному склерозі (РС), ви знайдете статті, які нібито відповідають на те саме запитання. Насправді це не так. В одній роботі хворим мишам давали метиленовий синій як лікування. В іншій ним узагалі не лікували жодної тварини. Його використовували як синій барвник на тонких зрізах спинного мозку, щоб патоморфолог міг побачити мієлін під мікроскопом.

Саме на цьому розрізненні ґрунтується вся стаття. У біології барвник має дві ролі, і між ними немає нічого спільного, крім флакона. Як потенційний лікарський засіб його вводять живій тварині й перевіряють, чи змінюється перебіг хвороби. Як барвник його наносять на неживу фіксовану тканину після експерименту й з’ясовують, який вигляд вона мала. Якщо не помітити цієї різниці, можна прочитати розділ із методами патоморфологічного дослідження так, ніби він описує результати лікування.

Що таке ЕАЕ простими словами

Експериментальний автоімунний енцефаломієліт, який зазвичай скорочують до ЕАЕ, — це стандартна тваринна модель окремих аспектів розсіяного склерозу. Дослідник імунізує сприйнятливу мишу фрагментом білка мієліну разом із сильним ад’ювантом. Після цього імунна система атакує власну центральну нервову систему тварини. У миші розвивається висхідна слабкість, яку легко оцінити за шкалою від 0 до 5: від млявого хвоста до паралічу задніх кінцівок.

Зручність такого оцінювання пояснює і популярність ЕАЕ, і те, чому ця модель може вводити в оману. РС у людей виникає самостійно, охоплює ширший і менш чітко визначений набір мішеней та спричиняє зорові, сенсорні, когнітивні, мозочкові й рухові симптоми за рецидивного або прогресувального перебігу. ЕАЕ відтворює окремі механізми, як-от запалення, демієлінізацію та ушкодження аксонів, у контрольованих умовах. Він не відтворює РС у мініатюрі. Читачі, які хочуть зрозуміти загальну картину, можуть спершу ознайомитися з тим, як, за наявними уявленнями, метиленовий синій діє на клітинному рівні, а вже потім оцінювати будь-яке окреме твердження щодо захворювання.

У двох наведених нижче роботах також використовували різні антигени для індукції ЕАЕ, і це важливо. У дослідженні лікування хворобу індукували за допомогою MOG35-55 — короткого пептиду мієлінового олігодендроцитарного глікопротеїну. У патоморфологічному дослідженні хворобу індукували за допомогою MP4 — злитого білка, що складається із сегментів основного білка мієліну та протеоліпідного білка. Вибір лінії мишей і антигену впливає на локалізацію уражень та перебіг запалення, тому ці дві роботи не є двома повтореннями одного експерименту.

Схема: від моделі до запитання й обмежень

Тримайте цю таблицю перед очима. Вона є основним орієнтиром для цієї статті. Кожен рядок показує, на яке клінічне запитання може відповісти модель, що насправді вимірювали та де закінчується можливість перенесення результатів.

Кожен, хто перевіряє черговий заголовок, може скористатися тими самими стовпцями та матеріалом про те, як читати доклінічні дослідження: з’ясувати вид тварин і антиген, роль сполуки, кінцеві точки, а також те, чи відображає результат перебіг хвороби, чи лише стан тканини в певний момент.

Результат лікування: що змінило введення препарату

У дослідженні лікування 2016 року в Journal of Neuroimmunology використовували самиць мишей C57BL/6 віком приблизно від 8 до 10 тижнів, імунізованих 250 мікрограмами MOG35-55 на мишу. Після індукції хвороби тварин з ЕАЕ випадковим чином розподілили до групи метиленового синього або до групи ЕАЕ без лікування, а клінічні оцінки відстежували приблизно до 30-го дня.

З 15-го до 30-го дня клінічні оцінки в мишей, які отримували лікування, були значуще нижчими, ніж у контрольній групі ЕАЕ, за P менше 0.01. Аналіз спинного мозку вказував у тому самому напрямку: у тварин, які отримували лікування, було менше запальної інфільтрації, демієлінізації та втрати аксонів.

Особливістю роботи був набір показників клітинної сигналізації. Лікування посилювало активацію AMPK та експресію SIRT1 і пригнічувало активацію NF-kB — центрального перемикача запалення. З боку адаптивного імунітету воно послаблювало відповідь Th17 і посилювало відповідь Treg. Отже, запропонований ланцюг такий: метиленовий синій — AMPK і SIRT1 — зниження сигналізації NF-kB — зсув від запальних Th17 до регуляторних Treg — менш виражене ушкодження тканин — нижчі оцінки.

Цей ланцюг є інтерпретацією, а не доведеною причинно-наслідковою послідовністю. Дослідження показує, що застосування препарату, зміни сигналізації та полегшення перебігу хвороби відбувалися разом. Воно не доводить, що AMPK і SIRT1 забезпечують увесь сприятливий ефект, а загальнодоступний індексований текст не розкриває точну дозу в міліграмах на кілограм, шлях введення, день початку чи тривалість достатньо чітко, щоб відтворити схему лише за анотацією. Вважайте будь-яку дозу, наведену щодо цієї роботи на сторінці продажу, неперевіреною, якщо вона не підкріплена посиланням на методи з повного тексту. Щоб з’ясувати, чи переріс цей ранній імунний сигнал у клінічні дані, варто звернутися до ширшої доказової бази досліджень метиленового синього в людей.

Патоморфологічний результат: що показала тканина за шість місяців

У дослідженні MP4 2015 року в PLoS ONE використовували самиць мишей C57BL/6, імунізованих 200 мікрограмами MP4 у повному ад’юванті Фрейнда з додатковим введенням кашлюкового токсину в день імунізації та повторно через 48 годин. Жодна тварина не отримувала метиленовий синій як лікарський засіб. Після фіксації та заливання поперечні зрізи спинного мозку завтовшки один мікрометр забарвлювали метиленовим синім для світлової мікроскопії, а для детальнішого вивчення використовували електронну мікроскопію вентролатерального тракту.

Зразки тканини відбирали на трьох етапах: на піку гострої фази у 7 мишей, через три місяці після початку хвороби у 5 мишей і через шість місяців після початку у 10 мишей. Середні клінічні оцінки на цих етапах виглядали майже однаково — приблизно від 1.7 до 1.8 за шкалою від 0 до 5. Тканина розповідала іншу історію. Кількість волокон з ізольованим ушкодженням мієліну зросла приблизно з 569,000 на квадратний міліметр на піку гострої фази до приблизно 1,496,000 через шість місяців; різниця між гострим і віддаленим етапами була значущою за P, що дорівнювало 0.027. Поєднане ушкодження мієліну й аксонів приблизно подвоїлося до шостого місяця. Частка волокон, у яких відбувалася ремієлінізація, залишалася нижчою за один відсоток на кожному етапі — деталь, яка змушує стриманіше оцінювати надії на відновлення.

Ушкодження аксонів мало U-подібну динаміку: високий рівень на піку гострої фази, нижчий через три місяці та найвищий через шість місяців. Воно корелювало з набуханням мітохондрій і зменшенням відстані між нейрофіламентами. Оцінювання проводили без знання клінічної оцінки та етапу хвороби, що посилює висновок: клінічні оцінки недостатньо відображали структурне ушкодження, яке тривало.

Саме ця невідповідність є головним внеском дослідження для читача, який цікавиться РС. Стабільна оцінка порушень функцій не означала стабільного стану тканини. Це також показує, чому ця робота не може підтверджувати жодне твердження про лікування РС метиленовим синім. У ній перевіряли вплив часу, а не лікування.

Чому жодне з досліджень не доводить користі для пацієнтів

Сприймайте кожну роботу як таку, що добре відповідає на вузьке запитання, але зовсім не відповідає на запитання про користь для пацієнтів.

По-перше, відрізняється причина. ЕАЕ навмисно індукують визначеним антигеном та ад’ювантом. РС у людей розвивається спонтанно за участю ширшого імунного репертуару, який охоплює Т-клітини, В-клітини, вроджений імунітет і резидентну глію. Сполука, яка змінює переважно спрямовану на MOG відповідь у миші, не обов’язково змінить цю ширшу відповідь у людини.

По-друге, відрізняється фенотип. Висхідна слабкість від хвоста до задніх кінцівок у миші — зручний показник. Він зводить різноманітність проявів РС у людей до одного числового показника рухових порушень. Препарати нерідко змінюють короткострокові оцінки ЕАЕ, не змінюючи перебігу хвороби в людей. Саме тому ЕАЕ — інструмент скринінгу та вивчення механізмів, а не клініка в мініатюрі.

По-третє, питання експозиції та часу застосування залишаються невирішеними. Безперервне введення на ранньому етапі в 30-денному експерименті на мишах — не те саме, що тривалий пероральний прийом людиною з уже розвиненим захворюванням, і жодне з досліджень не вимірювало рівні препарату в нервовій системі. Без цієї ланки немає підстав перейти від концентрації в лабораторній планшетці чи дози для миші до схеми застосування в людини.

По-четверте, ці дві роботи не відтворюють результати одна одної. Різні антигени, різні запитання, різні кінцеві точки, а в одному випадку — повна відсутність лікування. Цитувати їх разом як два позитивні дослідження лікування РС — це категоріальна помилка.

Що це означає для читачів, які зважують докази

У цих роботах немає встановленого протоколу застосування метиленового синього при РС. Дослідження лікування підтримує подальше вивчення AMPK, SIRT1, NF-kB та балансу Th17 і Treg при MOG-ЕАЕ. Патоморфологічне дослідження нагадує, що ушкодження тканин може прогресувати, навіть коли оцінки виглядають незмінними, а метиленовий синій у розділі методів іноді означає банку з барвником, а не ліки в аптечці. Читачам, які стежать за поточними дослідженнями розсіяного склерозу, слід пам’ятати про цю різницю між барвником і лікарським засобом. Питання безпеки, зокрема ризики для крові та ризики взаємодій, потрібно обговорювати з лікарем разом із загальними даними про безпеку метиленового синього, перш ніж діяти на підставі заголовків про лабораторні результати.

Підсумок уміщується в одне речення. В одному цитованому дослідженні метиленовий синій вводили мишам із MOG-ЕАЕ та повідомили про легший перебіг хвороби з протизапальним зсувом імунної відповіді, тоді як в іншому цитованому дослідженні не вводили жодного препарату й використовували метиленовий синій лише для забарвлення спинного мозку, документуючи накопичення ушкоджень мієліну й аксонів протягом шести місяців, тому разом ці дві роботи не доводять, що метиленовий синій допомагає при РС у людей.