Чи може метиленовий синій обходити мітохондріальний комплекс III? Чому дослідження суперечать одне одному

Дві лабораторії досліджували, чи може метиленовий синій обходити заблокований мітохондріальний комплекс III. Одна відповіла «ні». Інша — «так». Обидві мали дані.

Перше дослідження, на мітохондріях мозку мишей, показало, що барвник цього не може. Друге, на мітохондріях мозку трьох видів гризунів, показало, що частково може. Третє дослідження, на печінці мишей, часто згадують поруч, хоча воно перевіряло інше. Відведіть йому належне місце — і половина плутанини зникне.

Підстав оголошувати універсальний механізм немає. Є три експерименти з різними блокаторами, дозами та вимірюваними показниками. Спочатку розгляньте умови. Висновки випливають із них.

Що тут означає обхід

Електрони надходять у ланцюг через комплекс I (від NADH) або комплекс II (від сукцинату), проходять через комплекс III до цитохрому c, а потім через комплекс IV до кисню. Градієнт, що формується на цьому шляху, клітина використовує для утворення ATP.

Твердження про обхід означає, що метиленовий синій приймає електрони до місця блокування й передає їх після нього. Окиснений барвник приймає електрони від NADH або початкових компонентів ланцюга, перетворюючись на лейкометиленовий синій, а відновлена форма передає їх цитохрому c або повертає в ланцюг. Якщо передача відбувається після місця блокування, дихання та мембранний потенціал частково відновлюються. Якщо в місці блокування або до нього — нічого не відновлюється.

Одна особливість комплексу III значною мірою визначає цю суперечність. Комплекс здійснює Q-цикл із двома ділянками зв’язування інгібіторів. Антиміцин зв’язується з ділянкою Qi. Міксотіазол — із ділянкою Qo. Дослідження, яке використовує лише один із них, перевіряє лише половину комплексу.

Дослідження перше: обходу в мітохондріях мозку мишей немає

Гурєєв і колеги використовували мітохондрії кори головного мозку мишей C57BL/6, виділені за допомогою дигітоніну; аналіз проводили за концентрації білка 0.1 mg на ml. Субстрати охоплювали три режими: піруват і малат по 5 mM, сукцинат у концентрації 10 mM із глутаматом у концентрації 2 mM та L-пролін у концентрації 10 mM. Блокаторами були ротенон у концентрації 1 мікромоль/л (комплекс I) та антиміцин у концентрації 1 мікрограм на ml (комплекс III). Дози барвника становили 0.5, 1 і 2 мікромоль/л, а основною концентрацією була 1 мікромоль/л. Методи та криві вимірювань наведено в повідомленні у FEBS Letters.

Обхід комплексу I працював. Ротенон знижував стимульоване ADP дихання приблизно зі 121 до 2 nmol за хвилину на mg, а барвник у концентрації 1 мікромоль/л відновлював його приблизно до 21. Мембранний потенціал відновлювався на піруваті з малатом і на L-проліні.

Обхід комплексу III не працював. Антиміцин знижував дихання приблизно до 16, а барвник підвищував його лише приблизно до 20. Мембранний потенціал не відновлювався на жодному субстраті за доз барвника до 5 мікромоль/л. Дані щодо пероксиду вказували на те саме: сам барвник підвищував виділення пероксиду з базового рівня близько 76 pmol за хвилину на mg приблизно до 1170, 1460 і 1945 за трьох доз, проте антиміцин зменшував цей спричинений барвником сигнал приблизно на 25, 88 і 96 відсотків відповідно. Якби відновлений барвник безпосередньо реагував із киснем, блокування комплексу III не мало б пригнічувати сигнал. Автори дійшли висновку, що відновлений барвник окиснюється на ділянці Qo комплексу III, до місця блокування антиміцином. Короткий цикл словами: від донорів до барвника, від барвника до Qo, далі звичайним шляхом. Ротенон обходиться. Антиміцин — ні.

Дослідження друге: частковий обхід у трьох видів за блокування обох інгібіторних ділянок

Сваб і колеги розширили схему дослідження. Мітохондрії мозку мишей, щурів і морських свинок виділяли за допомогою Percoll та досліджували за тієї самої концентрації 0.1 mg на ml, використовуючи піруват із малатом або глутамат із малатом по 5 mM. Вони застосовували два блокатори комплексу III: антиміцин A у концентрації 0.3 мікромоль/л і міксотіазол у концентрації 1 мікромоль/л. Концентрація барвника становила 2 мікромоль/л у більшості аналізів і 0.5 у дослідах із цитохромом c. Дані для всіх трьох видів, отримані за узгодженими протоколами, наведено у статті у відкритому доступі.

Обидва блокування частково обходилися в усіх трьох видів. У мітохондріях мишей антиміцин пригнічував дихання, а барвник підвищував його приблизно на 60 відсотків — орієнтовно з 37 до 59 nmol за хвилину на mg. Міксотіазол пригнічував його на 88 відсотків, приблизно до 4.5, а барвник підвищував уп’ятеро — приблизно до 23. За дії будь-якого з інгібіторів мембрана частково реполяризувалася; потенціал вимірювали двома барвниками (сафраніном O та ратіометричним TMRM), щоб виключити оптичні артефакти.

У цій роботі також безпосередньо перевіряли передачу електронів, чого в першому дослідженні не робили. Екзогенний ацетильований цитохром c у концентрації 25 мікромоль/л не відновлювався енергізованими мітохондріями ні за наявності інгібіторів, ні без них, але додавання барвника спричиняло відновлення в обох випадках. У безклітинному буфері NADH із барвником відновлювали цитохром c зі швидкістю, пропорційною концентрації NADH. Довший перехід словами: від відновних еквівалентів до барвника, від барвника безпосередньо до цитохрому c, через комплекс IV до кисню. Цей шлях повністю оминає комплекс III, тому дає змогу обійти обидва блокатори.

Таке тлумачення підтримують два додаткові показники. Флуоресценція NAD(P)H знижувалася, коли барвник додавали до мітохондрій, оброблених міксотіазолом, — це означає, що відновні еквіваленти витрачалися через новий шлях. А поглинання барвника на 660 nm послідовно відображало кожне додавання, тоді як аналіз надосадових рідин після центрифугування показував більш ніж стократне накопичення окисненого барвника всередині енергізованих мітохондрій і його вихід після втрати потенціалу. Баланс протонів також узгоджується з цим: пропуск етапів перекачування залишає приблизно 2 протони на пару електронів замість 10, тож швидше споживання кисню за лише часткової реполяризації — це очікувана ознака справжнього обходу, а не свідчення проти нього.

Той самий препарат демонстрував реакції, які легко хибно витлумачити за поверхового читання. За наявності інгібітора й барвника ADP знижував дихання замість того, щоб підвищувати його, а блокування транспорту стимулювало його замість уповільнення, тоді як мембранний потенціал усе ще змінювався у звичних напрямках. Саме лише споживання кисню в цій системі вводить в оману.

Дослідження третє: робота на печінці, що перевіряла комплекси I та II, а не III

Лі та Бельстерлі використовували мітохондрії печінки мишей і культивовані гепатоцити, пошкоджені ефавірензом (комплекс I, IC50 близько 30 мікромоль/л) та гідразином, метаболітом ізоніазиду (комплекс II, IC50 близько 30 мікромоль/л). Барвник у концентрації приблизно 30 мікромоль/л відновлював окиснення NADH, мембранний потенціал і ATP, водночас знижуючи рівень окисників і некротичну загибель клітин. У статті в Redox Biology це описано моделлю, у якій барвник переносить електрони в обхід пошкоджених комплексів I та II.

Цей результат є підтвердженим контекстом для попередніх ланок ланцюга й нічого не говорить про комплекс III, оскільки його в цій роботі не блокували. Він не може ні підтвердити, ні спростувати жодне з досліджень на мозку.

Матриця умов

Чотири причини, чому обидва дослідження комплексу III можуть бути правильними для власних умов

1. Блокування було різним втручанням. Лише антиміцин у концентрації 1 мікрограм на ml проти антиміцину в концентрації 0.3 мікромоль/л і окремого блокатора ділянки Qo. Шлях барвника, що подає електрони на ділянку Qo, не працює саме там, де прямий шлях до цитохрому c працює. Одна ділянка не може представляти обидві.

2. Доза барвника й час вимірювання відрізнялися. Основні концентрації становили 1 проти 2 мікромоль/л — для речовини, що здійснює окисно-відновний цикл і чиє поглинання та пряме відновлення цитохрому c залежать від концентрації й часу. Невеликі відмінності доз разом із різним часом вимірювання можуть виявляти різні гілки однієї мережі.

3. Препарати відрізнялися. Виділення дигітоніном і виділення в градієнті Percoll відбирають популяції мітохондрій, які частково перекриваються, але не є ідентичними. Концентрація білка збігалася й становила 0.1 mg на ml, тому цю змінну можна виключити, але субпопуляцію та цілісність — ні. А підозру щодо впливу виду зняли: друга група відтворила спостережуваний фенотип і в мишей.

4. Субстратні умови визначають можливості барвника. Три субстратні режими проти пар, пов’язаних із NADH. Доступність NADH і мембранний потенціал разом визначають, наскільки швидко барвник відновлюється та де розподіляється, а шлях, якому потрібен відновлений барвник поруч з окисненим цитохромом c, залежить від цього вибору.

Як оцінювати наступне твердження про обхід

З’ясуйте, який комплекс блокували, яким інгібітором, на якій ділянці та в якій дозі. Запитайте про концентрацію барвника й час вимірювання. Уточніть тканину, вид, спосіб виділення, концентрацію білка та субстрат. І перевірте, чи узгоджуються між собою потенціал, дихання, окисно-відновний стан і прямий аналіз передачі електронів, адже саме лише споживання кисню тут не раз приводило до хибного висновку.

Вузький підсумок залишається чинним. Обхід комплексу I барвником не викликає розбіжностей. Щодо комплексу III: мітохондрії мишей за антиміцину в концентрації 1 мікрограм на ml і барвника в концентрації 1 мікромоль/л не демонструють функціонального обходу, тоді як три види за антиміцину в концентрації 0.3 мікромоль/л або міксотіазолу в концентрації 1 мікромоль/л і барвника в концентрації 2 мікромоль/л демонструють частковий обхід із прямим перенесенням електронів від барвника до цитохрому c. Ці твердження можуть співіснувати. Будь-яке ширше узагальнення — екстраполяція.

Пов’язані матеріали допомагають розглядати спірне твердження в межах безсумнівної хімії: як метиленовий синій переносить електрони — про механізм передачі, експерименти з обходу комплексу I — про підтверджений випадок у попередній ланці, вимірювання мембранного потенціалу та їхні артефакти — про те, навіщо знадобилися два барвники, а також лабораторна робота з речовинами, що здійснюють окисно-відновний цикл, — про пастки дозування та часу вимірювання.