Метиленовий синій і зір: що показують дослідження сітківки та де проходять їхні межі

Читач знаходить дослідження, у якому метиленовий синій захищав сітківку, і ставить закономірне запитання: чи варто вводити його в око? Дослідження впливу метиленового синього на зір не дають відповіді на це запитання, оскільки жодне з ключових досліджень не випробовувало такого застосування. В одному барвник вводили в склисте тіло мишей разом із токсином. В іншому його додавали до середовища, у якому перебували ізольовані клітини в чашці. У третьому його додавали до питної води мутантних мишей. Кожен результат стосується саме свого шляху введення та своєї моделі.

У цій статті розглянуто три доклінічні дослідження, два типи клітин сітківки та межу між захистом у лабораторних умовах і клінічним лікуванням очей. Загальна картина послідовна: метиленовий синій може змінювати мітохондріальний стрес у клітинах сітківки за контрольованих умов, але цей висновок не обґрунтовує нанесення роздрібних розчинів на око.

Два типи клітин, різні захворювання

Сітківка має шарувату будову, і те, про який шар ідеться, важливо. Світло спочатку потрапляє на фоторецептори в зовнішній частині сітківки. Їхні сигнали проходять через проміжні нейрони до гангліозних клітин у внутрішній частині сітківки, аксони яких виходять через зоровий нерв. На схемі нижче шари названо послідовно.

Гангліозні клітини сітківки — це клітини, які уражаються при глаукомі та оптичній нейропатії. Коли пошукові запити поєднують метиленовий синій і глаукому, зазвичай ідеться про цей внутрішній шар та його аксони. Фоторецептори — це клітини, які уражаються при дегенерації зовнішньої частини сітківки. Вони мають найвищі енергетичні потреби в сітківці та працюють майже на межі своєї дихальної здатності, тож мають мало резерву, коли мітохондріальний комплекс I перестає працювати. Результат для одного типу клітин не можна переносити на інший, і в трьох дослідженнях нижче їх розглянуто окремо. Загальний підхід до розмежування моделей і висновків пояснено в статті як читати дослідження метиленового синього.

Гангліозні клітини в оці живої миші

У найранішому з трьох досліджень дослідники моделювали оптичну нейропатію, вводячи ротенон мікроін’єкцією в склисте тіло одного ока миші, а інше око використовували як контроль із введенням розчинника. Ротенон блокує мітохондріальний комплекс I — початкову ланку, яка передає електрони від NADH далі. Порушення функції комплексу I також пов’язує цю модель зі спадковою оптичною нейропатією Лебера — захворюванням гангліозних клітин і зорового нерва.

Через двадцять чотири години шар гангліозних клітин в очах, у які вводили ротенон, був тоншим і містив менше клітин, ніж у контрольних очах. Коли метиленовий синій вводили одночасно з ротеноном, цьому пошкодженню запобігали залежно від дози: найвища випробувана доза (0.07 mg/kg, значно нижча за LD50 для мишей) зберігала і товщину шару, і кількість клітин. Паралельні випробування в гомогенатах мозку показали два ефекти: метиленовий синій усував спричинений ротеноном окиснювальний стрес і відновлював знижене споживання кисню. Автори запропонували ексайтотоксичний механізм, за якого ротенон пошкоджує амакринові клітини, що модулюють сигнали, гангліозні клітини надмірно активуються, а антиоксидантна дія перериває спричинене цим пошкодження. Запропоновані хімічні процеси, що лежать в основі такого захисту, докладно описано в статті мітохондріальні механізми дії метиленового синього.

Цей результат має три обмеження. Барвник вводили разом із токсином безпосередньо в око — це спосіб доставки, а не схема лікування. Період спостереження становив 24 години. А показники цитохромоксидази зростали в обох групах із пошкодженням, що автори трактували як надмірну активність, а не як доказ відновлення дихання в живій сітківці.

Гангліозні клітини, ізольовані в чашці

У другому дослідженні око як орган узагалі не використовували. Дослідники ізолювали первинні гангліозні клітини сітківки молодих щурів і піддавали їх дії ротенону, індуктора апоптозу стауроспорину або низького рівня кисню протягом 72 годин, після чого оцінювали виживання за допомогою забарвлення для розрізнення живих і мертвих клітин. Метиленовий синій у концентраціях 1 і 10 micromolar у культуральному середовищі поліпшував виживання за кожного з цих пошкоджувальних впливів приблизно в 1.5–1.9 раза залежно від умов. Супутнє випробування показало, що метиленовий синій зберігав активність цитохром-c-оксидази під час впливу пероксиду водню.

Це фармакологія ізольованих клітин. Сполука досягала клітин шляхом дифузії через культуральне середовище за визначеної концентрації, без рогівки, слізної плівки, кришталика, склистого тіла, кровопостачання чи імунної системи на її шляху. Саме в цій простоті й полягає сенс моделі: вона показує, що самі гангліозні клітини можна захистити, коли сполука їх досягає. Вона нічого не говорить про те, чи забезпечить крапля на поверхні рогівки будь-яку визначену концентрацію у внутрішній частині сітківки. Концентрацій понад 10 micromolar уникали через токсичність для тих самих клітин — це нагадування, що залежність ефекту від дози в чашці діє в обох напрямках.

Фоторецептори в мутантних мишей і клітинній лінії

Третє дослідження стосується зовнішньої частини сітківки. Дослідники використовували мишей Harlequin із дефіцитом фактора, що індукує апоптоз, через який комплекс I залишається не повністю зібраним, і досліджували структуру фоторецепторів, маркери зовнішніх сегментів та цілісність мітохондрій у віці 11 місяців. Після відлучення від матері метиленовий синій давали системно з питною водою в кількості близько 10 mg/kg на добу. У мутантних мишей, які його отримували, краще зберігалися товщина сітківки, маркери родопсину й опсину та структура мітохондрій, ніж у мутантних мишей, які його не отримували.

У супутній роботі з клітинами використовували клітини 661W — імморталізовану мишачу лінію, подібну до фоторецепторів, яку протягом 24 годин піддавали дії ротенону з метиленовим синім або без нього. Виживання поліпшувалося за концентрації 30 micromolar, а нижчі концентрації нормалізували співвідношення NADH до NAD+ і зменшували окиснювальний стрес. Особливо важливо те, чого метиленовий синій не робив: він не відновлював ATP. Захист супроводжувався послабленням окисно-відновного стресу та пригніченням стресових шляхів, зокрема відповіді на незгорнуті білки в мітохондріях і маркерів мітофагії, а не відновленням енергозабезпечення.

Ця відмінність важлива для тверджень про вплив метиленового синього на сітківку. Сполука може підтримувати життя фоторецептора в умовах стресу, не усуваючи його енергетичного дефіциту. Це звужує будь-яке пояснення можливого терапевтичного ефекту до окисно-відновного стресу, а не загального омолодження.

Порівняння трьох досліджень

У порівнянні нижче для кожного дослідження зазначено модель і шлях введення, оскільки саме ці два стовпці визначають, які висновки може підтвердити результат.

Кожен рядок описує доклінічне дослідження. У жодному не залучали пацієнтів, не оцінювали зір і не випробовували офтальмологічний препарат.

Чому це не лікування глаукоми

Лікування глаукоми спрямоване на зниження внутрішньоочного тиску. Нейропротекція має іншу мету: зберегти гангліозні клітини та їхні аксони живими в умовах стресу. Наведені вище дослідження стосуються другого завдання, а не першого. Жодне з них не знижувало тиск і не порівнювало метиленовий синій із лікуванням, що знижує тиск. Саме тому усталені підходи до лікування глаукоми та контролю тиску залишаються окремим питанням від окисно-відновної нейропротекції, а результат щодо виживання клітин не можна трактувати як збереження зору.

Відмінності шляхів введення додатково підкреслюють це. Одночасна інтравітреальна ін’єкція розміщує відому кількість речовини біля сітківки в момент пошкодження. Введення з питною водою забезпечує вплив на всю тварину протягом місяців, але концентрація в сітківці залишається невідомою. Культуральне середовище безпосередньо контактує з клітинами без тканинних бар’єрів. Жоден із цих способів не дає змоги передбачити, яка частка дози при місцевому застосуванні пройде через рогівку, уникне вимивання сльозами, подолає кришталик і склисте тіло та досягне будь-якого з шарів сітківки в концентрації, що може бути корисною. Ця проблема доставки є частиною ширшого питання шляхів введення та розподілу метиленового синього, де для кожного шляху потрібні окремі вимірювання концентрації.

Відмінності між тканинами створюють ще один бар’єр. Барвник, який досяг передньої частини ока, ще не досяг його задньої частини, а концентрація, що допомагає одному шару, може пошкодити інший. Роздрібні розчини не виготовляють, не стерилізують, не буферують і не консервують за вимогами до офтальмологічних препаратів, а чистота, pH, осмоляльність і допоміжні речовини мають значення для впливу на рогівку та внутрішні структури ока. Жоден із цих результатів щодо сітківки не підтверджує допустимість введення таких розчинів в око або нанесення їх на його поверхню. Питання стандартів виготовлення слід розглядати в контексті безпеки та поводження з метиленовим синім.

Де закінчується доказова база

Разом ці три роботи підтверджують вузьке твердження: за контрольованих умов метиленовий синій може послаблювати мітохондріальний окисно-відновний стрес у нейронах сітківки та зберігати їхню структуру. Межі цього твердження визначаються межами цих умов. Токсичні й генетичні моделі порушення комплексу I — це не глаукома, друзи чи діабетичне ураження. Короткі періоди спостереження та структурні кінцеві точки — це не тривале збереження зору. А захисна концентрація в одному компартменті — це не доза для іншого.

Для переконливішого обґрунтування потрібні окремі складові: визначена експозиція сітківки після введення клінічно придатним шляхом, функціональні кінцеві точки оцінювання зору у тварин, користь, незалежна від тиску, у моделі, релевантній глаукомі, а потім дані щодо безпеки й ефективності в людей. Доки їх немає, зв’язок між метиленовим синім і зором залишається дослідницькою гіпотезою з чіткими межами: правдоподібна мітохондріальна фармакологія в сітківці, продемонстрована лише на клітинах і тваринах, без підстав переходити від цих досліджень до лікування очей.