Метиленовий синій і діабет: що показують дослідження клітин і тварин

Питання за галасом

Такий висновок здається логічним, але спирається на хибну концептуальну модель. Вона зводить до одного три різні поняття: надходження глюкози в окрему клітину в лабораторній посудині, метаболізм усередині мітохондрії серця та контроль глюкози в організмі людини загалом. Кожне має власні показники й обмеження. Ця стаття розмежовує їх.

Коротка відповідь: метиленовий синій справді активує транспорт глюкози в одній добре вивченій клітинній лінії та змінює мітохондріальні хімічні процеси й деякі показники роботи серця у щурів із діабетом. Але в найдовшому дослідженні на щурах він не змінив рівень глюкози натще чи глікованого гемоглобіну, а опублікованих даних щодо людей, які б показували, що системне застосування метиленового синього покращує показники глюкози в крові, HbA1c або інсуліну при діабеті, немає.

Клітини: швидше надходження глюкози через транспортери, які вже є в мембрані

Дослідники використали фібробласти L929 — клітинну лінію, поглинання глюкози якою залежить від єдиного транспортера, GLUT1. Коли наявний лише один транспортер, будь-яка зміна поглинання має бути пов’язана саме з ним.

Коли команда піддала ці клітини дії метиленового синього, поглинання міченої речовини зросло протягом 10 хвилин і залежало від дози, досягаючи приблизно 800 відсотків початкового рівня за концентрації 50 micromolar протягом 45 хвилин. Кінетичні подробиці важливі: максимальна швидкість (Vmax) зросла, тоді як спорідненість (Km) і кількість білка GLUT1 залишилися незмінними. Та сама кількість «дверей» пропускала більше глюкози за хвилину. Барвник активував транспортери, які вже були в мембрані, а не додавав нові.

Контрольні експерименти уточнюють картину. Відновлена (безбарвна) форма не мала ефекту. Позаклітинний окисник, який не давав барвнику проникнути в клітини, блокував і забарвлення, і стимуляцію. Блокатори сигнальних шляхів AMP-кінази та PI-кінази нічого не змінили, що свідчить проти участі цих двох відомих сигнальних шляхів.

Першою гіпотезою був окисно-відновний цикл: барвник переносить електрони, спричиняє помірний стрес у клітині, а клітини під стресом відкривають «ворота» для глюкози. Подальше дослідження перевірило цю ідею. Дослідники використали метил-бета-циклодекстрин — кільцеподібну молекулу, яка утримує метиленовий синій у комплексі включення (константа асоціації близько 310 M-1). Утримуваний у комплексі барвник ані забарвлював клітини, ані стимулював поглинання, а вимивання барвника тісно корелювало зі зникненням ефекту. Їхній висновок суперечив окисно-відновній гіпотезі: активація, ймовірно, виникає через пряму взаємодію барвника з певним білком у шляху активації GLUT1, а не через загальний окисний стрес.

Цей механізм має вузькі межі. Метиленовий синій може швидко й оборотно активувати поглинання через GLUT1 у клітинах L929 завдяки проникненню в клітину та взаємодії на рівні білка. Це нічого не говорить про інсулін, підшлункову залозу чи рівень глюкози в крові живої тварини. Про роль барвника як переносника електронів читайте в матеріалі як метиленовий синій діє як переносник електронів. Про правила інтерпретації клітинних досліджень дивіться як читати дослідження метиленового синього.

Щури з діабетом: зміни в серці, незмінна глюкоза в крові

Дослідження на тваринах переходять до іншого поняття: серця при діабеті. В обох дослідженнях на щурах використали стрептозотоцин — токсин, який руйнує бета-клітини, що виробляють інсулін, і створює стан, подібний до діабету 1 типу. Читачам, які шукають інформацію про метиленовий синій і діабет 2 типу, варто відразу врахувати цю невідповідність. Це не тварини з діабетом 2 типу.

У дослідженні тривалого застосування самці щурів лінії Lewis отримували 10 mg на kg на день із питною водою протягом 11 тижнів разом із невеликими дозами інсуліну, щоб запобігти виснаженню, не нормалізуючи рівень глюкози. У мітохондріях серця барвник сприяв окисненню NADH, підвищував рівень NAD+ і посилював деацетилазну активність Sirtuin 3. Протеомний аналіз виявив зниження ацетилювання в 83 ділянках 34 мітохондріальних білків, залучених до окиснення жирів, циклу лимонної кислоти та транспорту електронів. Окиснення довголанцюгових жирів і активність гідроксіацил-КоА-дегідрогенази знизилися, що інтерпретували як послаблення стійкої надмірної залежності серця при діабеті від жирів. Об’єми та фракція викиду покращилися, а маркер гіпертрофії нормалізувався, хоча показники тиску й швидкості скорочення залишалися зниженими.

Ось найважливіший результат: глікемія не змінилася. Рівень глюкози натще й не натще залишався високим, а HbA1c тримався близько 5.6 відсотка як у щурів із діабетом, які отримували лікування, так і в тих, які його не отримували; значущого ефекту лікування не було. Барвник також не усунув порушення дихання за участю комплексів I та II в ізольованих мітохондріях. Деякі показники функції серця покращилися, тоді як контроль глюкози й основне порушення дихання — ні. Окремі результати залишилися окремими.

Друге дослідження проводили на нижчому рівні організації: мітохондрії, ізольовані зі здорових сердець і сердець тварин із двомісячним діабетом, під час вимірювання одноразово піддали дії низької концентрації 0.1 micromolar. Споживання кисню зросло як із субстратами комплексу I, так і комплексу II. Проте виділення пероксиду водню залежало від палива: зростало з глутаматом і малатом, знижувалося із сукцинатом. Утримання кальцію не змінилося. Це мітохондріальна фармакологія, а не дослідження функції серця чи рівня глюкози. Його висновок: барвник не є антиоксидантом з однаковою дією за всіх умов. Те, чи зростає або знижується виділення окисників, залежить від того, який субстрат окиснює мітохондрія. Дотичну тему розглянуто в матеріалі про метиленовий синій у серцево-судинних дослідженнях.

Таблиця моделей і кінцевих точок: що перевіряли, що змінилося, а що — ні

Модель	Що робив метиленовий синій	Вимірювана кінцева точка	Результат
Фібробласти L929, лише GLUT1, поглинання міченої речовини	Швидка активація наявних транспортерів, підвищення Vmax, незмінний Km, без появи нового білка GLUT1	Швидкість поглинання глюкози в лабораторній посудині	Зростання до ~8 разів за концентрації 50 micromolar, оборотне після вимивання
Фібробласти L929 із циклодекстриновою пасткою	Барвник утримувався поза клітинами, забарвлення зникало	Стимуляція поглинання	Блокувалася разом із забарвленням, що підтримує пряму взаємодію з білком, а не загальний окисно-відновний стрес
Щури зі STZ-індукованим діабетом, 10 mg/kg/day перорально, 11 тижнів	Окиснення NADH, підвищення NAD+, посилення активності Sirtuin 3, деацетилювання 83 мітохондріальних ділянок, зниження окиснення довголанцюгових жирів	Об’єми серця, фракція викиду, маркер гіпертрофії	Часткове покращення (об’єми, фракція викиду, нормалізація ANP; тиск і dP/dt залишалися зниженими)
Те саме дослідження тривалого застосування на щурах	Те саме дозування	Глюкоза натще, глюкоза не натще, HbA1c	Без значущих змін; діабет зберігався
Те саме дослідження тривалого застосування на щурах, ізольовані мітохондрії	Тривале пероральне застосування, потім вимірювання дихання ex vivo	Окисне фосфорилювання за участю комплексів I та II	Порушення не усунуто
Ізольовані мітохондрії здорових сердець і сердець при діабеті, короткочасний вплив 0.1 micromolar	Перенаправлення електронів під час респірометрії	Споживання кисню	Зростало із субстратами комплексів I та II
Те саме дослідження короткочасного впливу на мітохондрії	Те саме дозування	Виділення пероксиду водню	Залежало від субстрату: зростало з глутаматом/малатом, знижувалося із сукцинатом
Люди, системне застосування	Немає опублікованого дослідження з глікемічною первинною кінцевою точкою та оприлюдненими результатами	HbA1c, глюкоза натще, інсулін	Опублікованих даних про покращення не знайдено

Люди: даних про вплив на глікемію майже немає

Дослідження може вивчати рани в людей із діабетом, не досліджуючи контроль глюкози, а стоматологічна процедура може включати HbA1c як додатковий показник, не перевіряючи лікування діабету.

Одне зареєстроване дослідження, NCT05850611, передбачає пероральне застосування метиленового синього (70 mg у молоці, чотири тижні) при виразці діабетичної стопи з вимірюванням, зокрема, глюкози натще, інсуліну та HbA1c, але його результати не оприлюднено. Невелике опубліковане пілотне дослідження поєднувало гель плазми, збагаченої тромбоцитами, з низькою дозою барвника перорально при виразці стопи й повідомляло результати щодо рани та оксигенації, а не глікемії. Стоматологічні дослідження, у яких барвник застосовували місцево як активований світлом протимікробний засіб у пацієнтів із пародонтитом і діабетом, не виявили значущої переваги щодо HbA1c. Барвник у пародонтальній кишені — інша концепція, ніж системна метаболічна терапія, тож ці нульові результати також нічого не говорять про пероральне застосування.

Чесний підсумок: немає опублікованих даних щодо людей, які б показували, що системне застосування метиленового синього покращує HbA1c, глюкозу натще чи інсулін при діабеті. Відсутність доказів не доводить відсутності ефекту, але не дає підстав для маркетингових тверджень, які подають поглинання глюкози клітинами або результати щодо серця щурів як доказ контролю глюкози. Про обмеження з безпеки, які варто врахувати до будь-яких експериментів, зокрема ризик серотонінового синдрому при поєднанні з поширеними антидепресантами, дивіться безпека метиленового синього та взаємодії з лікарськими засобами.

Як використовувати ці дані, не вводячи себе в оману

Уявіть три механізми. Перший — це «двері» для глюкози в одній культивованій клітині. Другий — мітохондрія в серці щура. Третій — людина з діабетом, із підшлунковою залозою, печінкою, м’язами, нирками, ліками та прийомами їжі. Доведено, що барвник впливає на перший і другий механізми. Для третього не показано відповіді у вигляді кращого контролю глюкози.

Ця відмінність — суть статті в одному абзаці. Твердження про застосування метиленового синього при діабеті, яке посилається на активацію транспортера або мітохондріальне ацетилювання замість глікемічної кінцевої точки, підміняє предмет розмови. Результати щодо Sirtuin 3 та окиснення жирів і надалі варті уваги, але потрібний експеримент цілком конкретний: контрольоване дослідження в людей із діабетом, у якому HbA1c, глюкозу натще або інсулін вимірюють як первинну кінцеву точку.