Метиленовий синій і фероптоз: механізм перекисного окиснення ліпідів

Фероптоз — це загибель клітини внаслідок ушкодження мембрани. Поліненасичені жири в мембранах окиснюються в ланцюговій реакції, мембрана втрачає цілісність, і клітина гине. Для цієї хімічної реакції потрібне залізо. У цьому реченні — вся суть явища, а все в цій статті присвячене перевірці окремих його складових.

Тут питання вужче: як метиленовий синій впливає на цей ланцюг в експериментах на клітинах і що насправді показує такий результат. Коротка відповідь: у двох лабораторних дослідженнях метиленовий синій у наномолярних концентраціях зменшував перекисне окиснення мітохондріальних ліпідів і зберігав клітини живими після впливів, які без нього спричиняють фероптоз. Докладніша відповідь важливіша, адже кожну ланку цього ланцюга перевіряли окремим втручанням, і кожне втручання має свої обмеження.

Фероптоз в одному абзаці

Мембранний фосфоліпід із хвостом поліненасиченої жирної кислоти має слабке місце: атоми водню, які легко відірвати. Коли радикал відриває один із них, до ліпіду приєднується кисень, утворюється ліпідний пероксильний радикал, і цей радикал відриває водень від наступного ліпіду. Реакція поширюється вздовж мембрани, доки щось її не зупинить.

Основний механізм зупинки — фермент GPX4, який використовує глутатіон для відновлення пероксидів ліпідів до нешкідливих ліпідних спиртів. Лабораторні індуктори порушують цей захист у визначених точках. Ерастин блокує надходження цистину через систему xc-minus, позбавляючи клітину цистеїну для синтезу глутатіону. Бутіонінсульфоксимін безпосередньо блокує синтез глутатіону. RSL3 пригнічує сам GPX4. Усі три призводять до того, що пероксиди залишаються незнешкодженими, але діють на різних етапах, тому результат з одним індуктором не можна автоматично поширювати на інші.

Фероптоз відрізняється від апоптозу за визначальними ознаками. Каспазного каскаду й апоптичних тілець немає. Хелатори заліза, як-от дефероксамін, і речовини, що захоплюють радикали, як-от феростатин-1, пригнічують його. Саме цей практичний критерій дослідники використовують, щоб назвати загибель фероптотичною, а не просто некротичною. Ширший огляд шляхів регульованої клітинної загибелі допомагає зрозуміти цю відмінність, а те, як клітини поводяться з лабільним залізом, пояснює, чому хелатування є настільки вирішальним контролем.

Яка роль мітохондрій і чому вона була спірною

У ранніх роботах повідомляли, що клітини без мітохондріальної ДНК також зазнають фероптозу, що вказувало на необов’язковість мітохондрій. Пізніші роботи показали, що зменшення кількості мітохондрій або блокування дихання може пригнічувати фероптоз, спричинений нестачею цистеїну, але не прямим пригніченням GPX4. Обидва результати можуть бути правильними, якщо внесок мітохондрій залежить від індуктора, типу клітин і місця, де відбувається вирішальне перекисне окиснення.

Дослідження, на якому ґрунтується ця стаття, підійшло до цієї суперечності за допомогою зонда, специфічного для певного клітинного компартмента. MitoCLox — це мітохондріально спрямована версія індикатора перекисного окиснення ліпідів: його флуоресценція змінюється при взаємодії з ліпідними пероксильними радикалами всередині мітохондрій. У фібробластах, оброблених ерастином, окиснення мітохондріального зонда спостерігали ще в живих клітинах до їхньої загибелі, причому воно було неоднорідним у межах популяції. Ця послідовність у часі важлива. Перекисне окиснення, що передує загибелі, може бути її причиною. Перекисне окиснення, виміряне лише в мертвих клітинах, — це вже слід руйнування. У супровідному посібнику про методи аналізу перекисного окиснення ліпідів і те, що показує кожен зонд пояснено, чому розташування зонда визначає значення сигналу.

Та сама картина спостерігалася в другій моделі. Фібробласти пацієнта зі спадковою оптичною нейропатією Лебера, які мають мутацію комплексу I та вищий початковий рівень окиснювального стресу, гинули шляхом фероптозу при виснаженні глутатіону, тоді як контрольні фібробласти були стійкими. Окиснення мітохондріального зонда знову виникало раніше. Подробиці наведено в дослідженні перекисного окиснення мітохондріальних ліпідів при фероптозі у фібробластах.

Що змінив метиленовий синій у цих експериментах

Метиленовий синій — це окисно-відновний переносник. Його окиснена форма приймає електрони від реакцій, пов’язаних із NADH, на рівні комплексу I, а відновлена форма передає їх цитохрому c, який доставляє їх до комплексу IV. Це створює частковий обхід ділянки ланцюга, де електрони зазвичай витікають на кисень з утворенням супероксиду. Читачам, які хочуть зрозуміти повну схему перенесення, варто почати з матеріалу про те, як метиленовий синій переносить електрони в мітохондріях.

У фібробластах легень, оброблених ерастином, метиленовий синій у концентрації 250 наномолярів зберігав життєздатність за показниками аналізу виживання клітин, як і мітохондріально спрямовані антиоксиданти SkQ1 та MitoTEMPO. Контрольні досліди визначають межі цього висновку. Феростатин-1, альфа-токоферол і дефероксамін також забезпечували захист, що підтверджує фероптотичний характер загибелі. Аналог SkQ1 без антиоксидантної групи не захищав, що вказує на роль окисно-відновних реакцій, а не неспецифічного накопичення. Захист слабшав за концентрацій SkQ1 понад приблизно 200 наномолярів, що узгоджується з відомою прооксидантною поведінкою хінонових антиоксидантів за вищого навантаження. Метиленовий синій має таку саму двоїсту залежність дії від концентрації: у цих культурах він захищав за низьких наномолярних рівнів, але за вищих концентрацій або інтенсивного освітлення здатний утворювати пероксид водню через окисно-відновне циклювання. Такий контекст концентрацій розглянуто в матеріалі про активні форми кисню в мітохондріях.

Далі експерименти з ізольованими мітохондріями дозволили розмежувати джерела активних форм кисню (АФК). За наявності двовалентного заліза субстрати, що постачають електрони до комплексу I, разом із ротеноном стимулювали окиснення зонда. Ротенон блокує перенесення електронів після флавінового центру, тому попередні переносники залишаються відновленими, а електрони витікають на кисень із флавіну, зверненого до матриксу. Субстрати, що постачають електрони до комплексу III, разом з антиміцином A спричиняли утворення великої кількості пероксиду водню, але не запускали перекисне окиснення ліпідів. Той самий сумарний сигнал АФК, інше місце утворення, інший результат. І SkQ1, і метиленовий синій пригнічували перекисне окиснення, спричинене комплексом I, не пригнічуючи утворення самого пероксиду водню. Це вказує, що вони діють після утворення АФК, на етапі перекисного окиснення ліпідів.

Експерименти з перевантаженням залізом і підказка від ліпофусцину

Друге дослідження розглянуло це питання з боку заліза. У кардіоміоцитах H9c2, підданих впливу субмілімолярних концентрацій цитрату амонію-заліза(III), виникали мітохондріальні АФК, перекисне окиснення мітохондріальних ліпідів, потім фероптоз, а після цього — накопичення ліпофусциноподібного пігменту впродовж 24 годин. Ліпофусцин — це автофлуоресцентний залізовмісний залишок окиснених ліпідів і білків, який накопичується з віком. Його швидка поява тут пов’язує гостре перекисне окиснення під дією заліза з класичним маркером старіння. Метиленовий синій у наномолярних концентраціях і SkQ1 кожен запобігали перекисному окисненню, загибелі та накопиченню пігменту. Ізольовані мітохондрії серця підтвердили цю закономірність: ротенон разом із двовалентним залізом спричиняв перекисне окиснення та пігментоподібний сигнал, а обидві речовини блокували їх. Повну послідовність описано в дослідженні перевантаження залізом у кардіоміоцитах H9c2. Пігментний аспект цієї теми розглянуто в матеріалі про ліпофусцин і маркери клітинного старіння.

Чого не показують аналізи виживання клітин

Показник життєздатності, наприклад CellTiterBlue, відображає, скільки клітин у чашці залишаються метаболічно активними після впливу індуктора разом із потенційною захисною речовиною. Це перевірка механізму у визначеній системі. Це не результат лікування. У жодному з цих експериментів речовину не вводили пацієнту, не вимірювали кінцеву точку захворювання й не встановлювали терапевтичного вікна в організмі.

Чотири обмеження слід сформулювати прямо. По-перше, набір типів клітин вузький: трансформовані фібробласти легень, первинні фібробласти шкіри, зокрема одна лінія з мітохондріальним захворюванням, і лінія кардіоміоцитів щура, а також ізольовані мітохондрії серця щура. Чутливість різнилася між лініями, а лінію LHON навмисно обрали як особливо вразливу. По-друге, індуктори створюють крайні лабораторні умови: повне блокування транспорту або синтезу та навантаження залізом, яких жодна тканина не зазнала б за короткий час. По-третє, концентрацію не можна перерахувати простим множенням. Наномолярна концентрація в культуральному середовищі — це не доза для людини. Між чашкою й людиною стоять розподіл метиленового синього, його відновлення до безбарвної форми в крові й тканинах, вплив світла та мембранний потенціал. По-четверте, зонди відображають стан власного компартмента. Окиснення MitoCLox показує, що утворилися мітохондріальні ліпідні радикали; воно не показує, чи розриву плазматичної мембрани — імовірній кінцевій події — запобігли безпосередньо, чи його уникнули завдяки впливу на попередні етапи.

Отже, коректний висновок такий: у цих моделях АФК, що походять від комплексу I, разом із залізом запускають перекисне окиснення мітохондріальних ліпідів, яке передує фероптозу, а метиленовий синій у низьких концентраціях перериває цю ділянку ланцюга. Будь-які висновки поза її межами потребують інших експериментів на тваринах, а потім на людях.