Стаття
Альтернативи метиленовому синьому для мікроскопії: обирайте за завданням
Для простого бактеріального мазка кристалічний фіолетовий може замінити метиленовий синій, якщо мета — побачити форму клітин. Для живих клітин кращою альтернативою може бути фазово-контрастна мікроскопія взагалі без фарбування. Вибір залежить від того, яке спостереження потрібно провести.
Уявімо, що двоє людей досліджують ту саму бактеріальну культуру. Один хоче відрізнити паличкоподібні клітини від округлих. Інший хоче з’ясувати, чи спричинила обробка загибель бактерій. Барвник, який дає першому чітке зображення, може не дати другому придатної відповіді.
Перш ніж обирати заміну, завершіть це речення: «Мені потрібно спостерігати ___ у ___, і клітини повинні / не повинні залишатися живими». Це речення визначає завдання, яке має виконати фарбування.
Почніть зі зразка та запитання
Спочатку визначте, чи повинні клітини залишатися живими, а потім — яку ознаку потрібно спостерігати:
- Клітини повинні залишатися живими: для спостереження за рухом або формою розгляньте фазовий контраст без фарбування або DIC; для ядерної ДНК — Hoechst 33342 із флуоресцентною мікроскопією; для цілісності мембрани — валідований аналіз, наприклад SYTO 9 із пропідію йодидом.
- Клітини не повинні залишатися живими: для морфології бактерій розгляньте просте фарбування кристалічним фіолетовим або негативне фарбування нігрозином; для реакції за Грамом використовуйте повний метод фарбування за Грамом; для ядерної ДНК у фіксованих клітинах розгляньте флуоресцентне фарбування DAPI.
Скористайтеся цією таблицею, щоб порівняти обмеження кожного варіанта. Це вибір методів, а не інструкція із заміни одного флакона іншим у чинному протоколі.
| Що потрібно спостерігати | Зразок та обладнання | Можлива альтернатива | Основне обмеження |
|---|---|---|---|
| Форма та розташування бактерій | Підготовлений бактеріальний мазок; світлопольна мікроскопія | Просте фарбування кристалічним фіолетовим | Показує морфологію; не визначає реакцію за Грамом або життєздатність. |
| Контури клітин на темному фоні | Бактеріологічний препарат; світлопольна мікроскопія | Негативне фарбування нігрозином | Підготовка та склад реагенту мають значення; незабарвлена клітина не обов’язково є живою. |
| Реакція за Грамом | Підготовлений бактеріальний мазок; світлопольна мікроскопія | Повний метод фарбування за Грамом | Потребує повної послідовності реагентів і контролів. |
| Рух або зміни в живих клітинах | Сумісний вологий препарат; фазовий контраст або DIC | Без фарбування | Потребує відповідної оптики; контраст не ідентифікує молекулу. |
| Ядерна ДНК | Фіксовані клітини; флуоресцентна мікроскопія | DAPI | Потребує сумісних фільтрів збудження та емісії. |
| Ядерна ДНК у живих клітинах | Живі клітини; флуоресцентна мікроскопія | Hoechst 33342 | Проникнення в клітину не доводить, що умови візуалізації є нешкідливими. |
| Цілісність бактеріальної мембрани | Нефіксовані бактерії; флуоресцентна мікроскопія | SYTO 9 із пропідію йодидом | Фарбування мембрани є непрямим показником життєздатності. |
Для простого мазка замінюйте метод обережно
Кристалічний фіолетовий є практичним варіантом, коли завдання полягає в отриманні одноколірного зображення морфології бактерій. У Bacteriological Analytical Manual FDA наведено два склади кристалічного фіолетового, придатні для простого фарбування. Використовуйте задокументований склад і відповідний метод приготування; сама назва барвника не визначає робочий реагент.
Кристалічний фіолетовий також використовується у фарбуванні за Грамом, але це не робить просте фарбування кристалічним фіолетовим фарбуванням за Грамом. У протоколі фарбування за Грамом ASM диференційний результат залежить від послідовної дії кристалічного фіолетового, йоду, знебарвлення та контрфарбування. Пропуск цих етапів змінює те, що можна встановити за зображенням. Цю відмінність пояснено в матеріалі просте фарбування порівняно з фарбуванням за Грамом.
Нігрозин дає інший спосіб виявити контури: він затемнює фон, тоді як бактеріальні клітини залишаються відносно світлими. В інструкції Merck щодо нігрозину є важлива деталь, яку легко пропустити в загальному переліку замінників. Зазначений робочий склад містить формальдегід. Тому зі слів «негативне фарбування» не можна робити висновок про сумісність із живими клітинами, навіть якщо самі клітини виглядають незабарвленими. Перевіряйте повний склад і спосіб підготовки зразка.
Для живих зразків розгляньте зміну оптики
Якщо потрібно спостерігати за рухом або поділом клітин, додавання ще одного барвника може ускладнити спостереження. Як пояснює Nikon у своєму посібнику про контраст у прозорих зразках, фазовий контраст і диференційно-інтерференційний контраст, або DIC, роблять зразки видимими завдяки відмінностям у їхніх оптичних властивостях. Вони можуть показувати живі незабарвлені клітини, якщо мікроскоп має необхідні компоненти.
Такий вибір зберігає препарат незабарвленим, але змінює доступну інформацію. Можна відстежувати межу клітини або її рух, не знаючи, яка молекула створила контраст. Якщо питання стосується локалізації молекули, натомість оберіть відповідний метод мічення.
Для ядерної ДНК у порівнянні барвників DAPI та Hoechst від Invitrogen розмежовано типове використання DAPI з фіксованими клітинами та більш проникного для клітин Hoechst 33342, якому надають перевагу для мічення живих клітин. Обидва потребують флуоресцентного обладнання. Жоден із них не є прямою заміною кольорового барвника для світлопольної мікроскопії.
Розглядайте вплив барвника та освітлення як експериментальні умови. Порівнюйте забарвлені й незабарвлені препарати, коли вимірюваним параметром є поведінка клітин.
Червона клітина не обов’язково є мертвою клітиною
SYTO 9 і пропідію йодид часто використовують разом для оцінювання цілісності бактеріальної мембрани. У посібнику BacLight інтактні мембрани пов’язують із зеленим фарбуванням, а пошкоджені — із червоним. Таку інтерпретацію потрібно валідувати для конкретного зразка.
Дослідження Rosenberg і співавторів 2019 року демонструє цю проблему. У 24-годинних біоплівках E. coli на склі у фосфатно-сольовому буфері близько 96% клітин in situ виглядали позитивними за пропідію йодидом. Водночас автори оцінили, що після збирання 82% були здатними до культивування. Конфокальні зображення показали клітини із зеленим внутрішнім вмістом під матеріалом, забарвленим у червоний, що вказувало на позаклітинні нуклеїнові кислоти як джерело оманливого сигналу.
Ці відсотки описують різні вимірювання на препаратах із цього дослідження, а не універсальний поправочний коефіцієнт. Практичний висновок полягає в тому, щоб перевіряти, що саме створило сигнал. У біоплівці барвник нуклеїнових кислот може виявляти матеріал поза клітинами так само, як і всередині пошкоджених клітин. Для висновку про життєздатність дослідники рекомендують додаткові вимірювання, наприклад культивування або оцінювання метаболічної активності, водночас визнаючи, що кожен із цих методів має обмеження.
Перевірте, що насправді містить альтернатива
Альтернативний метод фарбування все одно може містити метиленовий синій. Прикладом є Giemsa: Merck описує свій продукт як розчин азур-еозин-метиленового синього, призначений, зокрема, для мазків крові та кісткового мозку. Це може бути інший метод для іншого зразка, але він не відповідає вимозі виключити метиленовий синій.
Якщо виключення певної сполуки є частиною експерименту, перед порівнянням зображень перевірте ідентичність і склад реагенту. Посібник про метиловий синій, метиленовий синій і барвники зі схожими назвами пояснює відмінності в назвах.
Перевірте заміну перед використанням результату
Для нового методу проведіть невелике порівняння з використанням репрезентативних зразків і відповідного контролю. За можливості зберігайте налаштування мікроскопа порівнюваними. Записуйте склад реагенту, підготовку зразка, експозицію та умови візуалізації, щоб зображення, яке виглядає кращим, можна було дослідити, а не просто віддати йому перевагу.
Оцінюйте успішність відповідно до початкового запитання. Для морфології перевіряйте, чи залишаються межі та розташування клітин придатними для інтерпретації. Для ядерного мічення оцінюйте локалізацію сигналу та фон. Для оцінювання життєздатності вимагайте доказів, що виходять за межі привабливого розділення кольорів. У ширшому посібнику про фарбування метиленовим синім і лабораторні застосування пояснено, як спостереження та підготовка зразка пов’язані між собою.
Обирайте альтернативу, яка зберігає потрібний вам вимірюваний параметр. Колір — лише одна з властивостей отриманого зображення.