Makale
Mikroskopi için metilen mavisi alternatifleri: göreve göre seçim
Basit bir bakteri yaymasında amaç hücre şeklini görmekse kristal viyole metilen mavisinin yerine kullanılabilir. Canlı hücreler için daha uygun alternatif, hiç boya kullanmadan faz kontrastı olabilir. Seçim, yapmanız gereken gözleme bağlıdır.
Aynı bakteri kültürünü inceleyen iki kişi olduğunu düşünün. Biri çubuk biçimli hücreleri yuvarlak hücrelerden ayırt etmek istiyor. Diğeri ise bir uygulamanın bakterileri öldürüp öldürmediğini bilmek istiyor. İlk kişiye net bir görüntü sağlayan bir boya, ikinci kişiye kullanılabilir hiçbir yanıt vermeyebilir.
Bir alternatif seçmeden önce şu cümleyi tamamlayın: “___ içinde ___ gözlemlemem gerekiyor ve hücrelerin canlı kalması gerekiyor / gerekmiyor.” Bu cümle, boyanın yerine getirmesi gereken görevi tanımlar.
Numune ve soruyla başlayın
Önce hücrelerin canlı kalmasının gerekip gerekmediğine karar verin, ardından gözlemlemeniz gereken özelliği belirleyin:
- Hücrelerin canlı kalması gerekiyor: hareket veya şekil için boyasız faz kontrastını ya da DIC'yi değerlendirin; çekirdek DNA'sı için floresanla Hoechst 33342'yi değerlendirin; zar bütünlüğü için SYTO 9 ile propidium iyodür gibi doğrulanmış bir test seçin.
- Hücrelerin canlı kalması gerekmiyor: bakteri morfolojisi için kristal viyole ile basit boyamayı veya nigrosin ile negatif boyamayı değerlendirin; Gram reaksiyonu için eksiksiz Gram boyama yöntemini kullanın; fikse hücrelerde çekirdek DNA'sı için DAPI floresansını değerlendirin.
Her dalın sınırlamalarını karşılaştırmak için bu tabloyu kullanın. Bunlar yöntem seçimleridir; mevcut bir protokolde şişeleri birbiriyle değiştirmeye yönelik talimatlar değildir.
| Gözlemlemeniz gereken | Numune ve ekipman | Aday alternatif | Temel sınırlama |
|---|---|---|---|
| Bakteri şekli ve dizilimi | Hazırlanmış bakteri yayması; aydınlık alan | Kristal viyole ile basit boyama | Morfolojiyi gösterir; Gram reaksiyonunu veya canlılığı belirlemez. |
| Koyu bir arka plana karşı hücre hatları | Bakteriyolojik preparat; aydınlık alan | Nigrosin ile negatif boyama | Hazırlama ve formülasyon önemlidir; boyanmamış bir hücre mutlaka canlı değildir. |
| Gram reaksiyonu | Hazırlanmış bakteri yayması; aydınlık alan | Eksiksiz Gram boyama yöntemi | Tam reaktif dizisini ve kontrolleri gerektirir. |
| Canlı hücrelerde hareket veya değişiklikler | Uyumlu yaş preparat; faz kontrastı veya DIC | Boya yok | Uygun optik bileşenler gerektirir; kontrast bir molekülü tanımlamaz. |
| Çekirdek DNA'sı | Fikse hücreler; floresans | DAPI | Uyumlu uyarma ve emisyon filtreleri gerektirir. |
| Canlı hücrelerde çekirdek DNA'sı | Canlı hücreler; floresans | Hoechst 33342 | Hücre içine girmesi, görüntüleme koşullarının zararsız olduğunu göstermez. |
| Bakteriyel zar bütünlüğü | Fikse edilmemiş bakteriler; floresans | Propidium iyodür ile SYTO 9 | Zar boyaması, canlılığın dolaylı bir ölçümüdür. |
Basit bir yayma için yöntemi dikkatle değiştirin
Görev, bakteri morfolojisini tek renkli olarak görüntülemek olduğunda kristal viyole pratik bir adaydır. FDA'nın Bakteriyolojik Analiz Kılavuzu, basit boyamaya uygun iki kristal viyole formülasyonu listeler. Belgelenmiş bir formülasyonu ve ona ait hazırlama yöntemini kullanın; yalnızca boyanın adı, kullanıma hazır bir reaktifi tanımlamaz.
Kristal viyole Gram boyamada da yer alır ancak bu, kristal viyole ile basit boyamayı Gram boyama yapmaz. ASM Gram boyama protokolünde ayırıcı sonuç, kristal viyole, iyot, renk giderme ve karşıt boyamanın sırayla uygulanmasına bağlıdır. Bu adımların atlanması, görüntünün neyi ortaya koyabileceğini değiştirir. Bu ayrım için basit boyama ile Gram boyamanın karşılaştırmasına bakın.
Nigrosin, hücre hatlarını görünür hâle getirmek için farklı bir yöntem sunar: bakteri hücreleri nispeten açık kalırken arka planı koyulaştırır. Merck'in nigrosin talimatlarında, genel bir alternatif listesinde gözden kaçabilecek önemli bir ayrıntı vardır. Belirtilen çalışma formülasyonu formaldehit içerir. Bu nedenle, hücrelerin kendileri boyanmamış görünse bile yalnızca “negatif boyama” ifadesinden canlı hücrelerle uyumluluk sonucu çıkaramazsınız. Formülasyonun tamamını ve numune hazırlama yöntemini kontrol edin.
Canlı numunelerde optiği değiştirmeyi değerlendirin
Hücrelerin hareketini veya bölünmesini izlemek istiyorsanız başka bir boya eklemek gözlemi karmaşıklaştırabilir. Nikon'un saydam numunelerde kontrast kılavuzunda açıkladığı gibi faz kontrastı ve diferansiyel girişim kontrastı, yani DIC, numuneleri optik özelliklerindeki farklılıklar yoluyla görünür hâle getirir. Mikroskop gerekli bileşenlere sahipse canlı ve boyasız hücreleri gösterebilirler.
Bu seçim preparatı boyasız tutar ancak erişilebilen bilgiyi değiştirir. Kontrastı hangi molekülün oluşturduğunu bilmeden bir sınırı veya hareketi izleyebilirsiniz. Sorunuz moleküler lokalizasyonla ilgiliyse bunun yerine uygun bir işaretleme yöntemi seçin.
Çekirdek DNA'sı için Invitrogen'in DAPI ve Hoechst boyalarını karşılaştırması, DAPI'nin fikse hücrelerle yaygın kullanımını, hücrelere daha kolay geçen ve canlı hücre işaretlemesinde tercih edilen Hoechst 33342'den ayırır. Her ikisi de floresans ekipmanı gerektirir. Hiçbiri renkli bir aydınlık alan boyasının doğrudan yerine geçmez.
Boyaya maruz kalmayı ve aydınlatmayı deneysel koşullar olarak ele alın. Ölçtüğünüz şey hücrelerin davranışıysa boyalı ve boyasız preparatları karşılaştırın.
Kırmızı bir hücre otomatik olarak ölü bir hücre değildir
SYTO 9 ve propidium iyodür, bakteriyel zar bütünlüğünü değerlendirmek için sıklıkla birlikte kullanılır. BacLight kılavuzu, bütünlüğünü koruyan zarları yeşil boyanmayla, hasarlı zarları ise kırmızı boyanmayla ilişkilendirir. Bu yorumun ilgili numune için doğrulanması gerekir.
Rosenberg ve meslektaşlarının 2019 tarihli bir çalışması sorunu örnekler. Fosfat tamponlu salin içindeki cam üzerinde oluşturulan 24 saatlik E. coli biyofilmlerinde hücrelerin yaklaşık 96% kadarı yerinde incelemede propidium iyodür pozitif görünmüştür. Buna karşın araştırmacılar, toplama işleminden sonra 82% kadarının kültürde üreyebilir olduğunu tahmin etmiştir. Konfokal görüntüler, kırmızı boyanmış materyalin altında yeşil iç kısımlara sahip hücreler göstermiş ve yanıltıcı sinyalde hücre dışı nükleik asitlerin rol oynadığını düşündürmüştür.
Bu yüzdeler evrensel bir düzeltme katsayısını değil, çalışmanın preparatlarında yapılan farklı ölçümleri tanımlar. Buradan çıkarılabilecek yararlı sonuç, sinyali neyin oluşturduğunu kontrol etmektir. Bir biyofilmde nükleik asit boyası, hasarlı hücrelerin içindeki materyalin yanı sıra hücrelerin dışındaki materyali de algılayabilir. Araştırmacılar, canlılığa ilişkin bir sonuca varmak için her birinin kendi sınırlamaları olduğunu kabul ederek kültürleme veya metabolik aktivite gibi tamamlayıcı ölçümlerin kullanılmasını önermektedir.
Alternatifin gerçekte ne içerdiğini kontrol edin
Alternatif bir boyama yöntemi yine de metilen mavisi içerebilir. Giemsa buna bir örnektir: Merck, ürününü kan ve kemik iliği yaymaları da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için tasarlanmış bir azure-eosin-methylene-blue çözeltisi olarak tanımlar. Farklı bir numune için farklı bir yöntem olabilir ancak metilen mavisini hariç tutma gereksinimini karşılamaz.
Bir bileşiğin hariç tutulması deneyin bir parçasıysa görüntüleri karşılaştırmadan önce reaktifin kimliğini ve formülasyonunu kontrol edin. Methyl blue, methylene blue ve benzer adlara sahip boyalar hakkındaki kılavuz, adlandırma farklılıklarını ele alır.
Sonucu kullanmadan önce değişikliği doğrulayın
Yeni bir yöntem için temsili numuneler ve uygun bir kontrol kullanarak küçük ölçekli bir karşılaştırma yapın. Mümkün olduğunda mikroskop ayarlarını karşılaştırılabilir tutun. Reaktif formülasyonunu, numune hazırlığını, maruz kalma koşullarını ve görüntüleme koşullarını kaydedin; böylece daha iyi görünen bir görüntü yalnızca tercih edilmek yerine incelenebilir.
Başarıyı başlangıçtaki soruya göre değerlendirin. Morfoloji için hücre sınırlarının ve diziliminin yorumlanabilir kalıp kalmadığını değerlendirin. Çekirdek işaretlemesi için sinyal konumunu ve arka planı değerlendirin. Canlılık için yalnızca çekici bir renk ayrımının ötesinde kanıt arayın. Daha kapsamlı metilen mavisi boyama ve laboratuvar uygulamaları kılavuzu, gözlem ile preparatın birbiriyle nasıl ilişkili olduğunu açıklar.
İhtiyaç duyduğunuz ölçümü koruyan alternatifi seçin. Renk, ortaya çıkan görüntünün özelliklerinden yalnızca biridir.