Metilen mavisi ve multipl skleroz: hayvan araştırmalarında neler test edildi?

MS için metilen mavisini araştırdığınızda, aynı soruyu yanıtlıyor gibi görünen makalelerle karşılaşırsınız. Oysa öyle değildir. Bir makalede hasta farelere tedavi olarak metilen mavisi verildi. Diğerinde ise hiçbir hayvana metilen mavisiyle tedavi uygulanmadı. Metilen mavisi, bir patologun miyelini mikroskop altında görebilmesi için ince omurilik kesitlerinde mavi bir boya olarak kullanıldı.

Makalenin tamamının temelinde bu ayrım yatıyor. Bu boyanın biyolojide iki rolü vardır ve aynı şişeden gelmeleri dışında ortak bir noktaları yoktur. İlaç adayı olarak canlı bir hayvana doz uygulanır ve hastalığın değişip değişmediği sorulur. Boya olarak ise deneyden sonra ölü, fikse edilmiş dokuya uygulanır ve dokunun nasıl göründüğü sorulur. Bu ayrımı gözden kaçırırsanız, bir patoloji yöntemleri bölümünü tedavi sonucuymuş gibi okursunuz.

EAE nedir? Sade bir açıklama

Genellikle EAE olarak kısaltılan deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun bazı yönlerini temsil etmek için kullanılan standart hayvan modelidir. Araştırmacı, duyarlı bir fareyi güçlü bir adjuvanla birlikte bir miyelin proteini parçası kullanarak bağışıklar. Ardından bağışıklık sistemi hayvanın kendi merkezi sinir sistemine saldırır. Farede, gevşek kuyruktan arka bacak felcine kadar uzanan ve 0 ile 5 arasındaki bir ölçekte kolayca puanlanabilen, aşağıdan yukarıya ilerleyen güçsüzlük gelişir.

Bu puanlama kolaylığı, EAE'nin neden yaygın kullanıldığını ve neden yanıltıcı olabildiğini de açıklar. İnsanlarda MS kendiliğinden ortaya çıkar, daha geniş ve daha az tanımlanmış bir hedef kümesini içerir; ataklarla seyreden veya ilerleyici süreçlerde görsel, duyusal, bilişsel, serebellar ve motor belirtilere yol açar. EAE, kontrollü koşullar altında inflamasyon, demiyelinizasyon ve akson hasarı gibi seçilmiş mekanizmaları yeniden oluşturur. MS'nin minyatür bir kopyasını oluşturmaz. Genel çerçeveyi öğrenmek isteyen okuyucular, herhangi bir hastalık iddiasını değerlendirmeden önce metilen mavisinin hücresel düzeyde nasıl etki gösterdiğinin düşünüldüğünü inceleyebilir.

Aşağıdaki iki makalede farklı EAE antijenleri de kullanıldı ve bu önemlidir. Tedavi çalışmasında hastalık, miyelin oligodendrosit glikoproteininden elde edilen kısa bir peptit olan MOG35-55 ile indüklendi. Patoloji çalışmasında ise miyelin bazik proteini ve proteolipid proteini parçalarının birleşiminden oluşan MP4 ile indüklendi. Fare suşu ve antijen seçimi, lezyonların nerede ortaya çıktığını ve inflamasyonun nasıl seyrettiğini değiştirir. Dolayısıyla bu iki çalışma, aynı deneyin iki tekrarı değildir.

Yol haritası: modelden soruya ve sınırlara

Bu tabloyu açık tutun. Makalenin temel başvuru kaynağıdır. Her satır, modelin hangi klinik soruyu ele alabileceğini, gerçekte neyin ölçüldüğünü ve bulguların insanlara uyarlanmasının nerede sınırlandığını belirtir.

Bir sonraki başlığı değerlendiren herkes, klinik öncesi çalışmaların nasıl okunacağına ilişkin rehberin yardımıyla aynı sütunları yeniden kullanabilir: türü ve antijeni, bileşiğin rolünü, sonlanım noktalarını ve sonucun hastalığın seyrini mi yoksa dokunun tek bir andaki görünümünü mü yansıttığını sorgulayın.

Tedavi sonucu: doz uygulaması neyi değiştirdi?

Journal of Neuroimmunology'de yayımlanan 2016 tarihli tedavi çalışmasında, yaklaşık 8 ila 10 haftalık dişi C57BL/6 fareler kullanıldı ve her fare 250 mikrogram MOG35-55 ile bağışıklandı. İndüksiyondan sonra EAE'li hayvanlar rastgele metilen mavisi grubuna veya tedavi uygulanmayan EAE grubuna ayrıldı; klinik puanlar yaklaşık 30. güne kadar izlendi.

15. günden 30. güne kadar, tedavi uygulanan farelerin klinik puanları EAE kontrol grubundakilere göre anlamlı derecede daha düşüktü; P değeri 0.01'den küçüktü. Omurilik analizleri de aynı yöndeydi: tedavi uygulanan hayvanlarda inflamatuvar infiltrasyon, demiyelinizasyon ve akson kaybı daha azdı.

Çalışmanın ayırt edici kısmı, incelenen sinyal göstergeleriydi. Tedavi, AMPK aktivasyonunu ve SIRT1 ekspresyonunu artırdı; inflamasyonda merkezi bir düzenleyici olan NF-kB'nin aktivasyonunu baskıladı. Edinilmiş bağışıklık tarafında ise Th17 yanıtını azalttı ve Treg yanıtını güçlendirdi. Bu nedenle önerilen zincir şöyleydi: metilen mavisi, ardından AMPK ve SIRT1, ardından NF-kB sinyallemesinde azalma, inflamatuvar Th17'den düzenleyici Treg'e doğru kayma, daha hafif doku hasarı ve daha düşük puanlar.

Bu zincir, kanıtlanmış bir nedensel sıra değil, bir yorumdur. Çalışma; ilaç uygulamasının, sinyal değişikliklerinin ve hastalıktaki iyileşmenin birlikte seyrettiğini gösteriyor. AMPK ve SIRT1'in yararın tamamına aracılık ettiğini kanıtlamıyor. Ayrıca kamuya açık olarak indekslenen metin, kilogram başına miligram cinsinden tam dozu, uygulama yolunu, başlangıç gününü veya süreyi, yalnızca özetten uygulama düzenini yeniden oluşturmayı sağlayacak açıklıkta vermiyor. Tam metnin yöntemler bölümüne atıf yapılmadığı sürece, bir satış sayfasında bu makaleyle ilgili belirtilen herhangi bir doz miktarını doğrulanmamış kabul edin. Bu erken bağışıklık bulgusunun daha sonra klinik verilere dönüşüp dönüşmediğini kontrol etmek için metilen mavisine ilişkin daha geniş insan verilerine bakılmalıdır.

Patoloji sonucu: altı aylık doku incelemesi ne gösterdi?

PLoS ONE'da yayımlanan 2015 tarihli MP4 çalışmasında, tam Freund adjuvanı içinde 200 mikrogram MP4 ile bağışıklanan dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Bağışıklama günü ve 48 saat sonra tekrar boğmaca toksini uygulandı. Hiçbir hayvana ilaç olarak metilen mavisi verilmedi. Fiksasyon ve gömme işlemlerinden sonra, bir mikrometre kalınlığındaki enine omurilik kesitleri ışık mikroskopisi için metilen mavisiyle boyandı; daha ince ayrıntılar için ventrolateral trakt elektron mikroskopisiyle incelendi.

Üç aşamada doku örneği alındı: akut zirvede 7 fareden, başlangıçtan üç ay sonra 5 fareden ve başlangıçtan altı ay sonra 10 fareden. Bu aşamalardaki ortalama klinik puanlar, 0 ile 5 arasındaki ölçekte yaklaşık 1.7 ila 1.8 düzeyinde, neredeyse aynı görünüyordu. Ancak doku farklı bir tablo ortaya koydu. Yalnızca miyelin hasarı bulunan liflerin sayısı, akut zirvede milimetrekare başına yaklaşık 569,000 iken altı ayda yaklaşık 1,496,000'e yükseldi. Akut dönem ile uzun dönem arasındaki karşılaştırma, P değeri 0.027 olmak üzere anlamlıydı. Miyelin ve akson hasarının birlikte görüldüğü liflerin sayısı altı ayda yaklaşık iki katına çıktı. Yeniden miyelinleşen lifler her aşamada yüzde birin altında kaldı; bu, onarım beklentileri açısından düşündürücü bir ayrıntıdır.

Akson hasarı U biçimli bir örüntü izledi: akut zirvede yüksekti, üç ayda daha düşüktü ve altı ayda en yüksek düzeye ulaştı. Mitokondri şişmesi ve nörofilamentler arası mesafenin azalmasıyla ilişkiliydi. Değerlendirme, puan ve aşama bilinmeden kör olarak yapıldı. Bu da klinik puanların devam eden yapısal hasarı olduğundan az yansıttığı yorumunu güçlendiriyor.

MS hakkında bilgi arayan bir okuyucu için çalışmanın asıl katkısı bu uyumsuzluktur. Engellilik puanının sabit kalması, dokunun da sabit kaldığı anlamına gelmiyordu. Bu durum, makalenin neden metilen mavisiyle MS tedavisine ilişkin hiçbir iddiayı destekleyemeyeceğini de gösteriyor. Çalışma tedaviyi değil, zamanı test etti.

Neden iki çalışma da hastalarda yarar sağlandığını ortaya koymuyor?

Her makaleyi, dar bir soruyu iyi yanıtlayan fakat hastalara ilişkin soruyu hiç yanıtlamayan bir çalışma olarak düşünün.

Birincisi, neden farklıdır. EAE, tanımlı bir antijen ve adjuvanla kasıtlı olarak tetiklenir. İnsanlarda MS; T hücrelerini, B hücrelerini, doğuştan gelen bağışıklığı ve yerleşik glia hücrelerini içeren daha geniş bir bağışıklık repertuvarıyla kendiliğinden gelişir. Farede MOG ağırlıklı bir yanıtı değiştiren bir bileşik, insanlardaki bu daha geniş yanıtı değiştirmek zorunda değildir.

İkincisi, fenotip farklıdır. Farede kuyruktan arka bacaklara doğru ilerleyen güçsüzlük, ölçülmesi kolay bir göstergedir. İnsanlardaki MS'nin çeşitliliğini tek bir motor puana indirger. İlaçlar, insanlardaki hastalık seyrini değiştirmeden kısa vadeli EAE puanlarını sıklıkla değiştirir. Bu nedenle EAE, minyatür bir klinik değil, tarama ve mekanizma araştırma aracıdır.

Üçüncüsü, maruziyet ve zamanlama açıklığa kavuşmamıştır. 30 günlük bir fare deneyinde erken dönemde başlayan sürekli doz uygulaması, hastalığı yerleşmiş bir kişinin uzun süreli ağızdan kullanımıyla aynı değildir. Ayrıca iki çalışma da sinir sistemindeki ilaç düzeylerini ölçmedi. Bu bağlantı olmadan, bir deney kabındaki konsantrasyon veya fareye verilen doz ile insanlarda kullanılacak bir uygulama düzeni arasında köprü kurulamaz.

Dördüncüsü, iki makale birbirini tekrarlamaz. Antijenler, sorular ve sonlanım noktaları farklıdır; üstelik birinde hiç tedavi uygulanmamıştır. Bunları MS tedavisi hakkında olumlu sonuç veren iki çalışma olarak birlikte sunmak, bir kategori hatasıdır.

Kanıtları değerlendiren okuyucular için bunun anlamı

Bu makalelerde MS için yerleşik bir metilen mavisi protokolü bulunmuyor. Tedavi çalışması, MOG EAE'de AMPK, SIRT1, NF-kB ve Th17 ile Treg dengesi üzerine daha fazla araştırma yapılmasını destekliyor. Patoloji çalışması ise puanlar sabit görünürken doku hasarının ilerleyebileceğini ve yöntemler bölümündeki metilen mavisinin bazen bir ilaç dolabından ziyade bir boya kavanozu anlamına geldiğini hatırlatıyor. Devam eden multipl skleroz araştırmalarını takip eden okuyucular, boya ile ilaç arasındaki bu ayrımı akılda tutmalıdır. Kanla ilgili riskler ve etkileşim riskleri de dahil olmak üzere güvenlik soruları, laboratuvar bulgularına ilişkin başlıklara dayanarak herhangi bir adım atılmadan önce, metilen mavisinin genel güvenlik verileriyle birlikte bir hekimle görüşülmelidir.

Sonuç tek bir cümleye sığar. Atıf yapılan çalışmalardan biri MOG EAE'li farelere metilen mavisi vererek inflamasyonu azaltan yönde bir bağışıklık değişimiyle birlikte daha hafif hastalık bildirdi; diğer çalışma ise hiçbir tedavi uygulamadan, altı ay boyunca biriken miyelin ve akson hasarını belgelerken metilen mavisini yalnızca omuriliği boyamak için kullandı. Dolayısıyla bu iki çalışma, metilen mavisinin insanlarda MS'ye yarar sağladığını ortaya koymaz.