Metilen mavisi mitokondriyal Kompleks III'ü baypas edebilir mi? Çalışmalar neden çelişiyor?

İki laboratuvar, metilen mavisinin bloke edilmiş mitokondriyal Kompleks III'ü baypas edip edemeyeceğini araştırdı. Biri hayır yanıtını verdi. Diğeri evet dedi. İkisinin de verileri vardı.

Fare beyni mitokondrileriyle yapılan ilk çalışma, boyanın bunu yapamadığını buldu. Üç kemirgen türünün beyin mitokondrileriyle yapılan ikinci çalışma ise kısmen yapabildiğini gösterdi. Fare karaciğeriyle yapılan üçüncü bir çalışmaya da bu bağlamda sıkça atıfta bulunuluyor, ancak o başka bir şeyi test etti. Onu doğru bağlamda değerlendirdiğinizde kafa karışıklığının yarısı ortadan kalkıyor.

İlan edilebilecek evrensel bir mekanizma yok. Farklı blokerler, dozlar ve ölçümler kullanan üç deney var. Önce koşulları okuyun. Sonuçlar bunların ardından geliyor.

Burada baypas ne anlama geliyor?

Elektronlar zincire Kompleks I üzerinden (NADH'den) veya Kompleks II üzerinden (süksinattan) girer, Kompleks III'ten geçerek sitokrom c'ye, ardından Kompleks IV üzerinden oksijene ulaşır. Hücrenin ATP üretmek için kullandığı şey, bu yol boyunca oluşturulan gradyandır.

Baypas iddiası, metilen mavisinin elektronları blokajın öncesinden alıp sonrasına aktardığını söyler. Oksitlenmiş boya, NADH'den veya zincirin erken bileşenlerinden elektron alarak lökometilen mavisine dönüşür; indirgenmiş form da bu elektronları sitokrom c'ye ya da yeniden zincire aktarır. Aktarım blokajın sonrasına yapılırsa solunum ve membran potansiyeli kısmen toparlanır. Aktarım blokaj noktasına veya öncesine yapılırsa hiçbir toparlanma olmaz.

Kompleks III'ün bir ayrıntısı bu tartışmanın büyük bölümünü belirler. Kompleks, iki inhibitör bölgesi olan bir Q döngüsüyle çalışır. Antimisin Qi bölgesine bağlanır. Miksotiyazol Qo bölgesine bağlanır. Bunlardan yalnızca birini kullanan bir çalışma, kompleksin yalnızca yarısını test etmiş olur.

Birinci çalışma: fare beyni mitokondrilerinde baypas yok

Gureev ve çalışma arkadaşları, C57BL/6 farelerinin korteksinden digitonin ile izole edilen mitokondrileri kullandı; ölçümler ml başına 0.1 mg protein konsantrasyonunda yapıldı. Üç substrat düzeni vardı: her biri 5 mM olan pirüvat ve malat, 2 mM glutamatla birlikte 10 mM süksinat ve 10 mM L-prolin. Blokerler, 1 micromolar rotenon (Kompleks I) ve ml başına 1 microgram antimisin (Kompleks III) idi. Boya dozları 0.5, 1 ve 2 micromolar olup ana konsantrasyon 1 micromolar olarak belirlendi. Yöntemler ve kayıtlar FEBS Letters kısa makalesinde yer alıyor.

Kompleks I baypası işe yaradı. Rotenon, ADP ile uyarılan solunumu mg başına dakikada yaklaşık 121 nmol düzeyinden yaklaşık 2 nmol düzeyine düşürdü; 1 micromolar boya bunu yaklaşık 21'e çıkardı. Pirüvat ve malat birlikte kullanıldığında ve L-prolin kullanıldığında membran potansiyeli toparlandı.

Kompleks III baypası işe yaramadı. Antimisin solunumu yaklaşık 16'ya düşürdü, boya ise bunu yalnızca yaklaşık 20'ye çıkardı. 5 micromolar düzeyine kadar boya dozlarında, hiçbir substratla membran potansiyeli toparlanmadı. Peroksit verileri de aynı yöne işaret etti: tek başına boya, peroksit salımını mg başına dakikada yaklaşık 76 pmol olan bazal düzeyden üç dozda sırasıyla yaklaşık 1170, 1460 ve 1945'e yükseltti; ancak antimisin, boyanın oluşturduğu bu sinyali sırasıyla yaklaşık yüzde 25, 88 ve 96 azalttı. İndirgenmiş boya doğrudan oksijenle tepkimeye girseydi, Kompleks III'ün bloke edilmesi sinyali baskılamamalıydı. Yazarlar, indirgenmiş boyanın Kompleks III'ün Qo bölgesinde, antimisin blokajının öncesinde oksitlendiği sonucuna vardı. Kısa döngü sözcüklerle şöyle: vericilerden boyaya, boyadan Qo'ya, oradan normal yol boyunca ileriye. Rotenon baypas edilir. Antimisin edilmez.

İkinci çalışma: üç türde, her iki inhibitör bölgesinde kısmi baypas

Svab ve çalışma arkadaşları deney tasarımını genişletti. Fare, sıçan ve kobay beyinlerinden Percoll ile izole edilen mitokondrilerde, yine ml başına 0.1 mg konsantrasyonda ölçüm yapıldı; substratlar, her biri 5 mM olan pirüvat ve malat ya da glutamat ve malattı. İki Kompleks III blokeri kullandılar: 0.3 micromolar antimisin A ve 1 micromolar miksotiyazol. Çoğu deneyde boya 2 micromolar, sitokrom c deneylerinde ise 0.5 düzeyindeydi. Üç türün aynı protokollerle incelendiği deneyler açık erişimli makalede yer alıyor.

Üç türün tamamında her iki blokaj da kısmen baypas edildi. Fare mitokondrilerinde antimisin solunumu baskıladı; boya bunu yaklaşık yüzde 60 artırarak mg başına dakikada yaklaşık 37 nmol düzeyinden 59 nmol düzeyine çıkardı. Miksotiyazol solunumu yüzde 88 baskılayarak yaklaşık 4.5'e düşürdü; boya bunu beş kat artırarak yaklaşık 23'e çıkardı. Her iki inhibitör altında da membran potansiyeli kısmen yeniden polarize oldu; optik artefaktları dışlamak için iki boya (safranin O ve rasyometrik TMRM) ile ölçüldü.

Bu makale, ilk çalışmanın hiç yapmadığı bir şeyi de yaptı: elektron aktarımını doğrudan test etti. Dışarıdan eklenen 25 micromolar asetillenmiş sitokrom c, inhibitörlerin varlığında veya yokluğunda enerjilendirilmiş mitokondriler tarafından indirgenmedi; ancak boya eklenmesi her iki durumda da indirgenmeyi sağladı. Hücresiz tamponda NADH ve boya birlikte, sitokrom c'yi NADH ile orantılı bir hızda indirgedi. Daha uzun sıçrama sözcüklerle şöyle: indirgenme eşdeğerlerinden boyaya, boyadan doğrudan sitokrom c'ye, Kompleks IV üzerinden oksijene. Bu yol Kompleks III'ü tamamen atlar; dolayısıyla her iki bloker de baypas edilebilir.

İki ek ölçüm bu yorumu destekliyor. Miksotiyazol uygulanmış mitokondrilere boya eklendiğinde NAD(P)H floresansı azaldı; bu, indirgenme eşdeğerlerinin yeni yol üzerinden tüketildiğini gösteriyordu. Ayrıca 660 nm'deki boya absorbansı, her eklemeyi sırayla izledi; santrifüj sonrası süpernatantlar ise oksitlenmiş boyanın enerjilendirilmiş mitokondrilerin içinde yüz katın üzerinde biriktiğini, potansiyel çöktüğünde de dışarı çıktığını gösterdi. Proton dengesi de buna uyuyor: pompalama basamaklarının atlanması, elektron çifti başına 10 yerine yaklaşık 2 proton bırakır. Bu nedenle daha hızlı oksijen kullanımıyla birlikte yalnızca kısmi yeniden polarizasyon görülmesi, gerçek bir baypasın beklenen görünümüdür; baypasa karşı bir kanıt değildir.

Aynı preparat, yüzeysel okumayla yanlış yorumlanabilecek yanıtlar da üretti. İnhibitör ve boya birlikteyken ADP solunumu artırmak yerine azalttı; taşımanın bloke edilmesi de solunumu yavaşlatmak yerine uyardı. Buna karşılık membran potansiyeli hâlâ normal yönlerde değişiyordu. Bu sistemde yalnızca oksijen tüketimine bakmak yanıltıcıdır.

Üçüncü çalışma: Kompleks III'ü değil, Kompleks I ve II'yi test eden karaciğer çalışması

Lee ve Boelsterli, efavirenz (Kompleks I, IC50 yaklaşık 30 micromolar) ve izoniazid metaboliti hidrazin (Kompleks II, IC50 yaklaşık 30 micromolar) ile hasar oluşturulan fare karaciğeri mitokondrilerini ve kültürdeki hepatositleri kullandı. Yaklaşık 30 micromolar boya, oksidanları ve nekrotik hücre ölümünü azaltırken NADH oksidasyonunu, membran potansiyelini ve ATP'yi yeniden sağladı. Redox Biology makalesi bunu, boyanın elektronları hasarlı Kompleks I ve II'nin çevresinden taşıması olarak modelliyor.

Bu sonuç, zincirin daha önceki basamakları için kabul gören bir bağlam sunar; ancak deneyde Kompleks III bloke edilmediği için onun hakkında hiçbir şey söylemez. İki beyin çalışmasından herhangi birini doğrulayamaz veya çürütemez.

Koşul matrisi

İki Kompleks III çalışmasının da kendi deney düzenekleri için doğru olabilmesinin dört nedeni

1. Bloker kullanımı aynı müdahale değildi. Bir tarafta ml başına 1 microgram tek başına antimisin; diğer tarafta 0.3 micromolar antimisin ve ayrıca ayrı bir Qo bölgesi blokeri vardı. Qo bölgesine elektron aktaran bir boya yolu, doğrudan sitokrom c'ye aktarım yolunun başarılı olduğu noktada başarısız olur. Tek bir bölge, ikisini birden temsil edemez.

2. Boya dozu ve zamanlama farklıydı. Ana konsantrasyonlar 1 ve 2 micromolar idi; üstelik söz konusu madde, hücreye alımı ve doğrudan sitokrom c indirgemesi konsantrasyona ve zamana bağlı olan bir redoks döngüleyicisiydi. Küçük doz farkları ve farklı ölçüm zamanları, aynı ağın farklı kollarını ortaya çıkarabilir.

3. Preparatlar farklıydı. Digitonin ile izolasyon ve Percoll gradyanıyla izolasyon, birbiriyle örtüşen ama aynı olmayan mitokondri popülasyonlarını seçer. Protein konsantrasyonu her ikisinde de ml başına 0.1 mg olduğundan bu değişken elenir; ancak alt popülasyon ve bütünlük elenmez. Tür farkı şüphesi de giderildi: ikinci grup aynı fenotipi farede de yeniden üretti.

4. Substrat durumu, boyanın neler yapabileceğini belirler. Bir tarafta üç substrat düzeni, diğer tarafta NADH bağlantılı çiftler vardı. NADH kaynağı ve membran potansiyeli birlikte, boyanın ne hızla indirgendiğini ve nerede dağıldığını belirler. Oksitlenmiş sitokrom c'nin yanında indirgenmiş boya gerektiren bir yol da bu seçime bağımlıdır.

Bir sonraki baypas iddiası nasıl okunmalı?

Hangi kompleksin, hangi inhibitörle, hangi bölgede ve hangi dozda bloke edildiğini sorun. Boya konsantrasyonunu ve ölçümün ne zaman yapıldığını sorun. Dokuyu, türü, izolasyon yöntemini, protein konsantrasyonunu ve substratı sorun. Ayrıca potansiyel, solunum, redoks durumu ve doğrudan aktarım deneyinin birbiriyle uyumlu olup olmadığını sorun; çünkü burada yalnızca oksijen tüketimi birden fazla kez yanlış yöne işaret etti.

Dar kapsamlı özet geçerliliğini koruyor. Boyanın Kompleks I'i baypas ettiği konusunda uzlaşı var. Kompleks III için ise ml başına 1 microgram antimisin ve 1 micromolar boya kullanılan fare mitokondrilerinde işlevsel baypas görülmüyor. Buna karşılık 0.3 micromolar antimisin veya 1 micromolar miksotiyazol ile 2 micromolar boya kullanılan üç türde, boyadan sitokrom c'ye doğrudan aktarımla birlikte kısmi baypas görülüyor. Bu cümleler aynı anda doğru olabilir. Daha geniş her yorum, bu bulguların ötesine geçen bir çıkarımdır.

İlgili okumalar, tartışmalı iddiayı tartışmasız kimya çerçevesinde tutar: elektron aktarımı için metilen mavisi elektronları nasıl taşır?, zincirin önceki basamaklarındaki kabul gören durum için Kompleks I baypas deneyleri, neden iki boya gerektiğini anlamak için membran potansiyeli ölçümleri ve artefaktları ve dozlama ile zamanlama tuzakları için redoks döngüleyicilerinin laboratuvarda kullanımı.