Metilen mavisi ve iskelet yaşlanması: hücre bulguları neden farelerdeki kemik sonuçlarını öngöremedi?

Kemiği parçalayan hücreleri baskılayan bir bileşiğin laboratuvar kabında test edildiğini ve tam da beklendiği gibi çalıştığını düşünün. Daha az çok çekirdekli osteoklast, belirgin bir doz yanıtı ve bunları açıklayabilecek makul bir mitokondri mekanizması. Ardından aynı bileşik, farelere yetişkin yaşamlarının büyük bölümünde veriliyor, iskeletleri üç boyutlu olarak taranıyor ve hiçbir fark görülmüyor. Tedavi uygulansa da uygulanmasa da yaşlı kemikler yaşlı görünüyor.

2024 tarihli bir çalışmanın sonuçları dürüstçe böyle özetlenebilir. Bunu tam olarak anlamak gerekir; çünkü çalışma, kemiklerle ilgili takviye iddialarının çoğunun çöktüğü noktada duruyor. Makale, Poudel ve çalışma arkadaşları tarafından hazırlanmış ve Mart 2024'te Aging dergisinde yayımlanmıştır. Açık erişimli olduğu için aşağıdaki her ölçüm kaynağından kontrol edilebilir. Çalışmanın temel bulgusu, etki saptanmamış olmasıdır. Etki saptanmayan sonuçlar başarısızlık değildir. Bunlar birer yanıttır ve bu çalışma dar kapsamlı bir soruya iyi bir yanıt verir: metilen mavisi veya mitokinon ile uzun süreli sistemik antioksidan uygulaması, yaşlanan fare iskeletini korur mu? Hayır.

Kemik yaşlanması sayılarla nasıl görünür?

Yaşa bağlı kemik kaybı tek bir olgudan ibaret değildir; bu nedenle çalışma da tek bir şeyi ölçmedi. Araştırmacılar mikro bilgisayarlı tomografi kullanarak iskeletin üç bölgesini taradı: femur diyafizinin orta bölümündeki kortikal kemik (yoğun gövde), femurun distal metafizindeki trabeküler kemik (ekleme yakın süngerimsi ağ) ve beşinci bel omurundaki trabeküler kemik. Her bölgede standart mikro mimari parametrelerini kaydettiler. BV/TV, bir hacmin kemik iliği boşluğu yerine kemikten oluşan oranıdır. BMD, mineral yoğunluğudur. Tb.Th, Tb.N ve Tb.Sp; trabekül kalınlığını, sayısını ve aralığını tanımlar. Kortikal kalınlık ve enine kesit alanları ise kemiğin gövdesini tanımlar.

Trabeküler kemiği bir deponun içindeki taşıyıcı iskele gibi düşünün. Yaşlanma bazı destekleri tamamen ortadan kaldırır, kalanları ise inceltir. Böylece yapının doldurduğu alanın oranı azalır, kalan destekler birbirinden uzaklaşır ve tüm yapı daha az yük taşır. Kortikal kemik ise deponun giderek incelen duvarıdır. İskeleti koruyan bir tedavinin etkisi bu sayılara yansımalıdır. Çalışmanın uyguladığı sınama buydu.

Laboratuvar kabında ne oldu?

Hücre deneylerinde, yaşlanma araştırmaları için yetiştirilen ve genetik çeşitlilik taşıyan UM-HET3 farelerinin femur ve tibialarından alınan kemik iliği kullanıldı. Fareler 6 ila 7 aylıktı. Dört bulgu elde edildi. Bunlar farklı yönlere işaret ettiği için her birini ayrı ele almak gerekiyor.

İlk olarak, gelecekte kemik oluşturan hücrelere dönüşecek hücreleri de içeren mezenkimal kök hücre havuzu, 48 saat boyunca 0.125 ila 0.5 mikromolar metilen mavisi ve mitokinon konsantrasyonlarında canlılığını korudu. Toksisite görülmedi, canlılıkta artış da olmadı. İkinci olarak, bu kök hücreler osteojenik besiyerinde osteoblastlara dönüşmeye yönlendirildiğinde ve 18. günde alkalen fosfataz için boyandığında, iki bileşik de test edilen hiçbir konsantrasyonda sonucu değiştirmedi. Laboratuvar kabının kemik yapan tarafı yanıt vermedi.

Üçüncü olarak, kemiği rezorbe eden taraf yanıt verdi. Osteoklast oluşturmak için kullanılan standart yöntem olan M-CSF ve RANKL ile uyarılmış kemik iliği öncül hücreleri, konsantrasyon yükseldikçe daha az TRAP pozitif çok çekirdekli hücre oluşturdu. Belirgin azalma 0.25 mikromoların üzerinde, uygulamada test edilen en yüksek konsantrasyon olan 0.5'te görüldü. Sayısız iyimser özete temel olan bulgu budur ve kendi sınırları içinde gerçektir: kültürde doğrudan ve sürekli maruziyet, osteoklast oluşumunu doza bağlı olarak baskıladı.

Dördüncü olarak, 48 saat maruz bırakılan ve mitokondriyal stres testine alınan olgun osteoblastlarda, iki bileşikten herhangi biriyle bazal veya maksimum oksijen tüketiminde anlamlı bir değişiklik görülmedi. 0.5 mikromolarda her ikisi de solunumu hafifçe azaltıyor gibi görünse de değişiklik istatistiksel anlamlılığa ulaşmadı. Dolayısıyla laboratuvar kabında, osteoklastları baskılayan etkinin yanında kemik oluşturan hücrelerde mitokondri işlevinde bir iyileşme görülmedi. Önerilen mekanizma olan mitokondriyal elektron taşıma zinciri üzerinden enerji metabolizmasının iyileştirilmesi, araştırmacıların bunu aradığı hücrelerde ölçülebilir bir solunum artışı sağlamadı.

Farelerde ne oldu?

Ardından, birbirinden çok farklı ölçeklerde iki hayvan deneyi yapıldı.

Daha küçük deneyde, biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan, soy içi yetiştirilmiş C57BL/6J dişi fareler kullanıldı. Fareler, yaklaşık olarak ileri orta yaşa karşılık gelen 18 aylıktan başlayarak iki gruba ayrıldı. Yarısı, 6 veya 12 ay boyunca, yani 24 veya 30 aylık olana kadar 250 mikromolar metilen mavisi içeren su içti. Uygulama yapılmayan 18 aylık dişiler başlangıç değerlerini sağladı; 5 aylık dişiler ise genç kemiğin nasıl göründüğünü gösterdi. Yaşlanma beklendiği gibi ilerledi. L5 omurunda kemik hacmi oranı yaklaşık yüzde 35, mineral yoğunluğu yaklaşık yüzde 18 azaldı; trabekül sayısı ise uygulamadan bağımsız olarak yaklaşık yarıya indi. Kortikal kalınlık, 18 ile 24 ay arasında yaklaşık yüzde 10, 30 aylıkta ise yaklaşık yüzde 30 azaldı. Metilen mavisi bu eğrilerin hiçbirinin seyrini değiştirmedi.

Daha büyük deney, aday bileşikleri her iki cinsiyetten UM-HET3 farelerinde üç merkezde test eden National Institute on Aging Interventions Testing Program kapsamında yürütüldü. Yemde milyonda 28 oranında metilen mavisi ve milyonda 100 oranında mitokinon uygulamalarının her biri erken yetişkinlikte başladı ve yaklaşık 22 ila 24 aylık yaşa kadar sürdü. Aynı üç iskelet bölgesi mikro-BT ile incelendi. Yayımlanan tablo, her parametreyi cinsiyete ve uygulamaya göre düzeltilmiş istatistiklerle bildiriyor. Uygulama sütunu baştan sona aynı sonucu veriyor: hiçbir bölgede anlamlı etki veya uygulama ile cinsiyet arasında etkileşim yok. Kortikal ya da trabeküler kemik, femur ya da omurga, erkek ya da dişi, metilen mavisi ya da mitokinon fark etmiyordu. İskelet beklenen zaman çizelgesinde yaşlandı.

İki deney grubunu eşleştiren tablo

Makalenin tamamı bu tabloya dayanıyor. Her satır, çalışmanın kendi ölçümlerini kullanarak aynı biyolojik süreç için laboratuvar kabında görülenlerle hayvanda görülenleri eşleştiriyor.

Tablo satır satır okunduğunda paradoks ortadan kalkar. Dört hücresel süreçten yalnızca biri yanıt verdi; o da yalnızca test edilen aralığın üst sınırına yakın konsantrasyonlarda, sürekli doğrudan maruziyet altında yanıt verdi. Laboratuvar kabındaki diğer tüm sonuçlarda zaten etki saptanmamıştı. Bu durumda hayvan sonucu, bir çelişkiden çok doğrulama gibi görünür: kültürde etki saptanmayan üç süreç ve koşula bağlı tek bir etki, hayvanda hiçbir ölçümde etki saptanmamasıyla sonuçlandı.

Kemik yapısı, yaşam süresi değildir

Bir karışıklık ayrı bir bölümü hak ediyor; çünkü metilen mavisinin yaşam süresine ilişkin verileri var ve bunları kemik verileri olarak yanlış okumak kolay. Interventions Testing Program'ın önceki kohortunda, aynı besinsel dozda metilen mavisi, UM-HET3 dişilerinde yaşam süresinin 90. yüzdelik dilimini yaklaşık yüzde 6 artırdı. Bu, yaşamın ileri dönemindeki sağkalıma ilişkin bir etkiydi; medyan yaşam süresi değişmedi ve erkeklerde etki görülmedi. Mitokinonun iki cinsiyette de yaşam süresine etkisi görülmedi. Bu sağkalım sayıları kemik makalesinden değil, programın yayımlanmış yaşam süresi kayıtlarından geliyor.

Kemik makalesinin katkısı, bu iki veri grubunu birbirinden ayrı tutmasıdır. Bir bileşik, iskeletin ölçülen hiçbir özelliğini korumadan, tek bir cinsiyette yaşamın ileri dönemindeki sağkalımı değiştirebilir. Sağkalım tüm nedenlere bağlı ölümleri sayar; mikro-BT ise bir omurdaki destek yapılarını sayar. Bir müdahalenin yaşamı uzatmak için kemik üzerinden etki etmesini gerektiren bir kural yoktur. Bu çalışma, metilen mavisinin dişilerde yaşamın ileri döneminde görülen etkisinin başka bir yoldan gerçekleştiğine doğrudan kanıt sunar. Yaşam süresi bulgusunu metilen mavisi ve osteoporoz lehine kanıt olarak kullanan biri, yanlış hesaptaki kaynağı harcıyor demektir. Bu veri gruplarını ayrı tutmaya ilişkin genel yaklaşım, metilen mavisi araştırmalarını nasıl okumalı? yazısında ele alınıyor.

Laboratuvar kabı neden fareyi öngöremedi?

Verilerle uyumlu beş açıklama var ve bunlar birbirini dışlamıyor.

İlki maruziyet. Kültürdeki hücreler, bilinen konsantrasyonlara sürekli maruz bırakıldı. Fareler aylarca bileşik eklenmiş yem yedi; ancak çalışmada ne kemik iliğindeki ilaç düzeyleri ne de kemikteki oksidatif hasara ilişkin herhangi bir belirteç ölçüldü. Doğrudan uygulandığında osteoklastları baskılayan bir konsantrasyon, kemik iliğindeki öncül hücrelere hiçbir zaman aynı düzeyde ulaşmayabilir. Makalede her bileşik için in vivo tek bir doz test edildiğinden, hayvandaki doz yanıtı bilinmiyor.

İkincisi kimya. Reaktif oksijen türleri, hücre içinde homojen biçimde karışmış tek bir havuz oluşturmaz. Küçük bölmelerde, kısa zaman aralıklarında etki gösterirler. Mitokondriyal, sitozolik ve zarla ilişkili redoks devreleri kısmen birbirinden bağımsız çalışır. Mitokinon, tasarımı gereği mitokondrilerde birikirken osteoklast oluşumunu yönlendiren oksidan sinyaller başka yerlerden kaynaklanabilir. Bir havuzun düzeyini düşürmek, tüm hücrenin sürekli maruziyetinin sağladığı sonucu tekrarlamak zorunda değildir.

Üçüncüsü, süreçler arasındaki bağlantı. Canlı kemikte rezorpsiyon ve oluşum birbirine bağlıdır: osteoklastlar ve komşu hücreleri, kemik oluşturan hücreleri yeni rezorbe edilmiş bölgeye çeken sinyaller yayar. Osteoklast oluşumunu baskılamak, eşit miktarda kemik eklenmesini sağlamaz; çünkü bu baskılama, yapıcı hücreleri çağıran sinyalleri de ortadan kaldırabilir. Yalnızca öncül hücreler içeren bir laboratuvar kabı bu geri bildirimi gösteremez. Bir iskelette ise bunun etkisi gizli kalamaz.

Dördüncüsü mekanik yüklenme. Osteositler mekanik gerinimi algılar ve tüm kemiğin yeniden yapılanma dengesini belirler. Hayvanlar yaşlanıp daha az hareket ettikçe mekanik sinyal zayıflar. Tek bir hücre türü üzerindeki sınırlı farmakolojik etkiye rağmen kayıp devam eder. Yazarlar da egzersizi ve kemik yapımını uyaran yüklenmeyi daha olası bir etki yolu olarak gösteriyor. Bu, iskeletin redoks kimyasından çok fiziğe yanıt verdiğini söylemenin nazik bir yoludur.

Beşincisi zamanlama; ancak bunun bir sınırı var. C57BL/6J deneyinde uygulama, önemli ölçüde yapısal kaybın zaten gerçekleştiği 18 aylık yaşta başladı. Rezorpsiyonu baskılayan hiçbir ajan, eşlik eden bir kemik oluşumu uyarısı olmadan delinmiş ve ortadan kalkmış trabekülleri yeniden oluşturamaz. Ancak zamanlama açıklamanın tamamını karşılayamaz; çünkü Interventions Testing Program'da doz uygulaması erken yetişkinlikte başladı ve yine de hiçbir şeyi değiştirmedi. Geç başlangıç, bir deneyin sonucunu kısmen açıklar. Diğer deneyin sonucunu ise hiç açıklamaz.

Bu, metilen mavisi ve osteoporoz iddiaları için ne anlama geliyor?

Metilen mavisini kemik sağlığı veya iskelet yaşlanması açısından değerlendiren bir okuyucu için pratik yorum kısa. Mevcut en iyi uzun süreli fare verileri, kültürde gerçek bir osteoklast baskılama sinyali görülmesine rağmen kronik metilen mavisi veya mitokinon uygulamasının iskelete yarar sağlamadığını bildiriyor. Yaşam süresi literatürü, metilen mavisinin yalnızca dişilerde, yaşamın ileri döneminde sınırlı bir etkisi olduğunu gösteriyor. Bu çalışma ise söz konusu etkinin kemik üzerinden gerçekleşmediğini gösteriyor. İki veri grubu da insanlarda osteoporoz için kullanımı desteklemiyor; üstelik değerlendirmede insan kemiğine ilişkin hiçbir veri yer almıyor. İnsanlarda doz uygulaması ve ürün güvenliği soruları, bu fare iskeleti çalışmasının değil, metilen mavisinin güvenliği ve yan etkileri konusunun kapsamına giriyor.

Daha temel ders, kanıtların sıralanışıyla ilgili. Bir hücre sonucu, bir bileşiğin kontrollü maruziyet altında tek bir hücre türünde ne yapabildiğine ilişkin bir iddiadır. Bir kemik sonucu ise aylarca süren sistemik maruziyetin, mekanik kontrol altında iki hücre türünü birbirine bağlayan bir organda ne yaptığına ilişkin bir iddiadır. İlki hipotezlerin doğduğu yerdir. İkincisi ise iskelet yaşlanması ve bu iki antioksidan için söz konusu hipotezin geçerliliğini yitirdiği yerdir.