Metilen mavisi ve ferroptoz: demir, lipit peroksidasyonu ve hücre ölümü

Ferroptoz, zar hasarından kaynaklanan hücre ölümüdür. Zarlardaki çoklu doymamış yağlar bir zincirleme reaksiyonla oksitlenir, zar işlevini kaybeder ve hücre ölür. Bu kimyasal süreç için demir gereklidir. Kavramın tamamı bu cümlede özetlenir ve bu makaledeki her şey, onun bir bölümünü sınamaktadır.

Buradaki soru daha dar kapsamlıdır: Metilen mavisi hücre deneylerinde bu zincire ne yapar ve elde edilen sonuç gerçekte neyi gösterir? Kısa yanıt şu: İki laboratuvar çalışmasında nanomolar düzeyde metilen mavisi, mitokondriyal lipit peroksidasyonunu azalttı ve normalde ferroptoza neden olan tetikleyicilerden sonra hücreleri hayatta tuttu. Uzun yanıt daha önemlidir; çünkü zincirin her halkası farklı bir müdahaleyle sınandı ve her müdahalenin sınırları vardır.

Bir paragrafta ferroptoz

Çoklu doymamış yağ asidi kuyruğu taşıyan bir zar fosfolipidinin zayıf bir noktası vardır: kolayca koparılabilen hidrojen atomları. Bir radikal bunlardan birini kopardığında lipide oksijen eklenir, bir lipit peroksil radikali oluşur ve bu radikal bir sonraki lipitten hidrojen koparır. Bir şey onu durdurmadıkça reaksiyon zar boyunca yayılır.

Başlıca durdurucu, lipit peroksitlerini zararsız lipit alkollerine indirgemek için glutatyon kullanan GPX4 adlı enzimdir. Laboratuvar tetikleyicileri bu savunmaya belirli noktalardan saldırır. Erastin, sistem xc-minus üzerinden sistin alımını engelleyerek hücreyi glutatyon sentezi için gereken sisteinden mahrum bırakır. Butionin sülfoksimin, glutatyon sentezini doğrudan engeller. RSL3 ise GPX4'ün kendisini inhibe eder. Üçü de peroksitlerin giderilmeden kalmasına yol açar, ancak bunu farklı basamaklarda yaparlar; bu nedenle bir tetikleyiciyle elde edilen sonuç diğerlerine otomatik olarak genellenemez.

Ferroptoz, onu tanımlayan özellikler bakımından apoptozdan farklıdır. Kaspaz kaskadı ve apoptotik cisimcikler görülmez. Deferoksamin gibi demir şelatörleri ve ferrostatin-1 gibi radikal yakalayıcı ajanlar ferroptozu baskılar. Araştırmacılar, bir ölümü yalnızca nekrotik değil, ferroptotik olarak tanımlamak için bu deneysel ölçütü kullanır. Düzenlenmiş hücre ölümü yollarının daha geniş çerçevesi bu ayrımı anlamlandırır; hücrelerin labil demiri nasıl işlediği ise şelasyonun neden bu kadar belirleyici bir kontrol olduğunu açıklar.

Mitokondrilerin rolü ve bunun neden tartışmalı olduğu

İlk çalışmalar, mitokondriyal DNA'sı olmayan hücrelerin de ferroptoz geçirdiğini bildirdi; bu da mitokondrilerin zorunlu olmadığını düşündürdü. Daha sonraki çalışmalar, mitokondrilerin azaltılmasının veya solunumun engellenmesinin sistein yoksunluğundan kaynaklanan ferroptozu baskılayabildiğini, ancak doğrudan GPX4 inhibisyonundan kaynaklanan ferroptozu baskılayamadığını buldu. Mitokondriyal katkı tetikleyiciye, hücre tipine ve belirleyici peroksidasyonun nerede gerçekleştiğine bağlıysa her iki sonuç da doğru olabilir.

Bu makalenin temelini oluşturan çalışma, tartışmaya hücresel bölmeye özgü bir probla yaklaştı. MitoCLox, bir lipit peroksidasyonu göstergesinin mitokondriye hedeflenmiş sürümüdür: Mitokondri içinde lipit peroksil radikalleriyle karşılaştığında floresansı değişir. Erastin uygulanan fibroblastlarda mitokondriyal prob oksidasyonu, hücreler henüz canlıyken, ölümden önce ortaya çıktı ve hücre popülasyonu içinde heterojen bir dağılım gösterdi. Bu zamanlama önemlidir. Ölümden önce gerçekleşen peroksidasyon, olası bir nedendir. Yalnızca ölü hücrelerde ölçülen peroksidasyon ise yıkımdan geriye kalandır. Lipit peroksidasyonu testleri ve her probun neyi gösterdiği hakkındaki tamamlayıcı rehber, bir sinyalin anlamını neden probun konumunun belirlediğini ele alır.

Aynı örüntü ikinci bir modelde de görüldü. Leber herediter optik nöropatisi olan bir hastadan alınan, kompleks I mutasyonu taşıyan ve başlangıçtaki oksidatif stres düzeyi daha yüksek olan fibroblastlar, glutatyon tükendiğinde ferroptozla öldü; kontrol fibroblastları ise buna direnç gösterdi. Mitokondriyal prob oksidasyonu yine önce gerçekleşti. Ayrıntılar, ferroptozda mitokondriyal lipit peroksidasyonunu inceleyen fibroblast çalışmasında yer alıyor.

Metilen mavisi bu deneylerde neyi değiştirdi?

Metilen mavisi bir redoks taşıyıcısıdır. Oksitlenmiş biçimi, kompleks I'deki NADH bağlantılı kimyasal süreçlerden elektron kabul eder; indirgenmiş biçimi ise bunları kompleks IV'e elektron sağlayan sitokrom c'ye aktarır. Bu, zincirin elektronların normalde süperoksit oluşturacak şekilde oksijene sızdığı bölümünü kısmen baypas eder. Elektron aktarımının bütününü görmek isteyen okurlar, metilen mavisinin elektronları mitokondrilerde nasıl taşıdığı ile başlayabilir.

Erastin uygulanan akciğer fibroblastlarında 250 nanomolar metilen mavisi, mitokondriye hedeflenmiş antioksidanlar SkQ1 ve MitoTEMPO gibi, hücre sağkalımını ölçen bir testte canlılığı korudu. Kontroller, bu bulgudan çıkarılabilecek sonucu belirler. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol ve deferoksamin de koruma sağladı; bu da ölümün ferroptotik olduğunu doğrular. Antioksidan grubu bulunmayan SkQ1 analoğu koruma sağlamadı; bu, özgül olmayan birikimden ziyade redoks kimyasına işaret eder. SkQ1'in yaklaşık 200 nanomolar üzerindeki düzeylerinde koruma zayıfladı; bu durum, kinon antioksidanlarının daha yüksek yüklerde bilinen prooksidan davranışıyla uyumludur. Metilen mavisi de doza bağlı aynı iki yönlü davranışı gösterir: Bu kültür kaplarında düşük nanomolar düzeylerde koruyucudur; daha yüksek düzeylere çıkarıldığında veya güçlü ışığa maruz bırakıldığında ise redoks döngüsü yoluyla hidrojen peroksit üretebilir. Bu tür doz bağlamı, mitokondrilerde reaktif oksijen türleri yazısında ele alınır.

Ardından izole mitokondri deneyleri ROS kaynaklarını birbirinden ayırdı. Demir(II) varlığında, kompleks I'e elektron sağlayan substratlar ve rotenon birlikte prob oksidasyonunu artırdı. Rotenon, flavin bölgesinin aşağısındaki elektron akışını engeller; böylece yukarı akıştaki taşıyıcılar indirgenmiş durumda kalır ve matrikse bakan flavinden oksijene elektron sızar. Kompleks III'e elektron sağlayan substratlar ve antimisin A birlikte bol miktarda hidrojen peroksit üretti, ancak lipit peroksidasyonunu tetiklemedi. Toplam ROS sinyali aynıydı; konum farklıydı ve sonuç da farklıydı. Hem SkQ1 hem de metilen mavisi, hidrojen peroksit üretiminin kendisini baskılamadan kompleks I kaynaklı peroksidasyonu baskıladı. Bu, etkilerinin ROS oluşumundan sonra, lipit peroksidasyonu basamağında gerçekleştiğini gösterir.

Demir yüklenmesi kolu ve lipofuscin ipucu

İkinci bir çalışma, soruya demir açısından yaklaştı. Milimoların altındaki düzeylerde ferrik amonyum sitrata maruz bırakılan H9c2 kardiyomiyositlerinde önce mitokondriyal ROS, ardından mitokondriyal lipit peroksidasyonu ve sonra ferroptoz gelişti; bunları 24 saat içinde lipofuscin benzeri bir pigmentin birikmesi izledi. Lipofuscin, oksitlenmiş lipit ve proteinlerin yaşla birlikte biriken, otofloresan özellikli, demir içeren kalıntısıdır. Burada hızla ortaya çıkması, demirin tetiklediği akut peroksidasyonu klasik bir yaşlanma belirteciyle ilişkilendirir. Nanomolar metilen mavisi ve SkQ1'in her biri peroksidasyonu, ölümü ve pigment birikimini önledi. İzole kalp mitokondrileri bu örüntüyü doğruladı: Rotenon ve demir(II) birlikte peroksidasyonu ve pigment benzeri sinyali tetikledi; her iki ajan da bunları engelledi. Sürecin tamamı, H9c2 kardiyomiyositlerinde demir yüklenmesi çalışmasında bildiriliyor. Konunun pigment yönü, lipofuscin ve hücresel yaşlanma belirteçleri ile birlikte ele alınmalıdır.

Hücre sağkalım testleri neyi göstermez?

CellTiterBlue gibi bir canlılık ölçümü, bir tetikleyici ve koruyucu adayının birlikte uygulanmasından sonra kültür kabında kaç hücrenin metabolik olarak aktif kaldığını gösterir. Bu, tanımlanmış bir sistemde bir mekanizmanın sınanmasıdır. Bir tedavi sonucu değildir. Bu deneylerin hiçbirinde bir hastaya doz uygulanmadı, bir hastalık sonlanım noktası ölçülmedi veya vücutta bir terapötik aralık belirlenmedi.

Dört sınır açıkça belirtilmelidir. Birincisi, hücre tipleri sınırlıdır: transforme akciğer fibroblastları, bir mitokondriyal hastalık hattını da içeren primer deri fibroblastları ve bir sıçan kardiyomiyosit hattının yanı sıra izole sıçan kalbi mitokondrileri. Duyarlılık hücre hattına göre değişti ve LHON hattı, deney tasarımı gereği olağan dışı ölçüde hassastı. İkincisi, tetikleyiciler laboratuvara özgü uç koşullardır: taşımanın veya sentezin tamamen engellenmesi ve hiçbir dokunun akut olarak karşılaşmayacağı demir yükleri. Üçüncüsü, konsantrasyon bir çarpma işlemiyle doza dönüştürülemez. Kültür ortamındaki nanomolar düzey bir insan dozu değildir. Metilen mavisinin dağılımı, kan ve dokuda renksiz biçimine indirgenmesi, ışığa maruz kalma ve zar potansiyeli, kültür kabıyla insan arasındaki farkı belirleyen etkenlerdir. Dördüncüsü, problar kendi bulundukları bölmeyi gösterir. MitoCLox oksidasyonu, mitokondriyal lipit radikallerinin oluştuğunu gösterir; muhtemel son olay olan plazma zarının yırtılmasının, yukarı akıştaki süreçlere müdahaleyle dolaylı olarak önlenmek yerine doğrudan engellendiğini göstermez.

Dolayısıyla dürüstçe söylenebilecek olan şudur: Bu modellerde kompleks I kaynaklı ROS ile demir birlikte, ferroptozdan önce gerçekleşen mitokondriyal lipit peroksidasyonunu tetikler ve düşük konsantrasyonlardaki metilen mavisi bu bölümü kesintiye uğratır. Bu bölümün ötesindeki her çıkarım, önce hayvanlarda, ardından insanlarda farklı deneyler gerektirir.