Metilen mavisinin absorpsiyonu derişimle neden değişir?

Bir şişe metilen mavisi stok çözeltisi alın ve iki bardağa dökün. İlkini stok çözeltiden, ikincisini ise on kat seyreltilmiş çözeltiden doldurun. Beklendiği gibi ikinci bardaktaki çözelti daha soluktur. Yakından baktığınızda başka bir şeyin de değiştiğini görürsünüz. Renk tonu kaymıştır. Çözeltilerden biri berrak bir gök mavisine, diğeri ise morumsu bir maviye yaklaşır. Seyreltme, renk yoğunluğunu azaltmakla kalmamıştır. Absorpsiyonun büyük bölümünden sorumlu kimyasal türü de değiştirmiştir.

Bu kaymanın ardındaki kavram basittir. Çözünmüş metilen mavisi tek bir türden oluşmaz. Monomer adı verilen tek boya katyonu, ikinci bir katyonla yüz yüze istiflenerek bir dimer oluşturabilir; dimerler de daha büyük agregatlara dönüşebilir. Her biçimin kendine özgü bir absorpsiyon spektrumu vardır. Spektrofotometrenin bildirdiği sonuç, o küvette ve o koşullarda bulunan karışımın toplam katkısıdır. Karışımı değiştirdiğinizde, toplam boya içeriği doğrusal bir seyreltme oranını izlese bile spektrum değişir.

Monomer ve dimer ışığı farklı biçimde absorplar

Monomeri, pozitif yükü halka sistemi boyunca dağılmış düz bir kart gibi düşünün. Bu kartlardan ikisi yüz yüze yerleşebilir. Pozitif yükler birbirini iter; ancak düz aromatik yüzeyler istiflenme etkileşimleriyle birbirini çeker, çevredeki su ve karşı iyonlar da itmeyi perdeler. Sonuç, ortak elektronik durumlara sahip, birbirine bağlı bir çifttir. Bu çiftin izinli geçişleri monomerin geçişinden daha yüksek enerjidedir; dolayısıyla dimer bandı, monomer bandından daha kısa dalga boyunda görünür. Daha büyük agregatlar ise spektrumun mavi tarafına doğru bir omuz şeklinde ek katkı sağlar.

Temiz suda çok düşük derişimlerde monomerler baskındır ve uzun dalga boyundaki bant öne çıkar. Toplam derişim arttıkça eşleşmiş biçimin payı büyür ve kısa dalga boyundaki bant, ilk banda göre güçlenir. Bu nedenle iki bandın oranı, doğrudan toplam derişimi değil, karışımın bileşimini gösterir. Tek bir dalga boyunda yapılan ölçüm, hangi biçimin bulunduğuna ilişkin bir varsayım olmadan bu ikisini ayıramaz.

Referans spektrumların her zaman koşullarıyla birlikte verilmesinin nedeni budur. Metilen mavisinin spektral referansı, bant konumlarını bunların elde edildiği çözücü, tuz ortamı, pH, sıcaklık ve derişim aralığıyla birlikte tablolar. Bu koşulları belirtmeden bir pik değerini aktarırsanız sayı eksik tanımlanmış olur. İki laboratuvar, farklı karışımları ölçtükleri için aynı boyadan elde edilen farklı spektrumlar konusunda da haklı olabilir.

Dengeyi neler değiştirir?

Derişim, başlıca etkendir. Dimer oluşumu iki monomerin karşılaşmasını gerektirdiğinden, dimerin payı toplam boya miktarıyla doğrusal artıştan daha hızlı yükselir. Oda sıcaklığına yakın koşullarda sulu çözeltiler için bildirilen dimerleşme sabitleri molar başına binler düzeyindedir; bu nedenle dimer payı mikromolar aralık boyunca hızla artar. Mikromolar ile milimolar boya derişimlerini kapsayan geniş bir küresel uyum analizinde, 34 mikromoların altında bile sıfırdan farklı bir tetramer katkısı bulunmuştur. Bu, onlarca mikromolar düzeyinde kesin olarak iki türle sınırlı bir uyum modeline güvenilmemesi gerektiğini gösterir. Kesin oranlar ortama bağlıdır; bu yüzden bu makale evrensel bir dönüşüm tablosu yerine değişim yönlerini sunar.

Tuz, ikinci etkendir. Çözünmüş iyonlar iki katyon arasındaki itmeyi perdelediğinden, eklenen sodyum klorür ve benzeri elektrolitler aynı boya derişiminde karışımı dimerlere ve agregatlara doğru kaydırır. Bu etki, yaklaşık 1 mikromolar ile 3.4 milimolar arasındaki boya derişimlerinin 0 ile 0.15 molar sodyum klorür aralığında ölçüldüğü metilen mavisinin tuzlu ve sulu ortamlardaki agregasyonunu inceleyen çalışmalarda görülür. Bu uyum analizinde tetramer oranı, yüksek boya ve yüksek tuz koşullarının kesiştiği uçta yaklaşık 0.93'e ulaşmıştır. Dolayısıyla suda kaydedilen bir spektrum ile fizyolojik tuzlu çözeltide kaydedilen bir spektrum, birbirinin yerine kullanılabilecek standartlar değildir.

Sıcaklık ters yönde etki eder. İstiflenme, bağlı suyu serbest bırakır ve termal hareket istiflenmeye karşı koyar. Bu nedenle bir çözeltiyi ısıtmak genellikle dimerlerin bir kısmını yeniden monomerlere ayırırken, soğutmak birleşmeyi destekler. Uyum analizinden elde edilen ayrışma entalpisi negatiftir; 282 ile 333 kelvin arasında mol başına yaklaşık eksi 30 kilojuldür. Bu da birleşmenin ekzotermik olduğunu doğrular. Buzdolabından çıkarıldıktan hemen sonra ölçülen soğuk bir numune, oda sıcaklığına dengelendikten sonra ölçülen aynı numuneye göre daha fazla agregasyon göstermiş gibi görünebilir.

Çözücü, temel durumu belirler. Güçlü hidrofobik etkisiyle su, düz boya katyonlarının istiflenmesini teşvik eder. Etanol ve metanol gibi alkoller halkaları daha iyi solvatlar ve agregatları dağıtır; bu nedenle aynı boya derişimi etanolde, suya kıyasla daha fazla monomer içeren bir görünüm verir. Aprotik yardımcı çözücüler de aynı etkiyi gösterir: 293 kelvinde su ve DMSO karışımlarına eklenen DMSO, dimerleşmeyi baskılamıştır. Bu durum, suyun yapısının istiflenmeyi yönlendiren bir etken olduğuna işaret eder. Yüzey aktif maddeler her iki yöndeki etkileri açısından dikkat gerektirir. Kritik misel derişimlerinin üzerinde miseller, monomerleri tek tek çözünür hâle getirerek monomer benzeri bir spektrumu geri kazandırabilir. Bu noktanın altında ise zıt yüklü bir yüzey aktif madde istiflenmeyi teşvik edebilir: 100 mikromolar boya derişiminde, SDS kaynaklı polimerleşme, daha yüksek yüzey aktif madde düzeylerinde yeniden dağılım gerçekleşmeden önce, misel oluşum noktasının yaklaşık yarısı olan 4 milimolar SDS civarında en yüksek düzeye ulaşmıştır. Boya-çözücü ve organize ortamların metilen mavisi spektrumları üzerindeki etkilerini inceleyen çalışmalar, gözlenen bantları yalnızca çözeltinin genel derişiminin değil, yakın moleküler çevrenin de ne kadar güçlü biçimde belirlediğini gösterir.

pH, esas olarak uç değerlerde önemlidir. Çoğu laboratuvar çalışmasında kullanılan nötre yakın aralıkta metilen mavisi, bilinen katyonik mavi biçiminde kalır ve spektral davranışta agregasyon baskındır. Kuvvetli asit veya baz, renksiz löko biçimini üreten redoks kimyası ya da proteinlere ve parçacıklara bağlanma, monomer-dimer çiftinin ötesinde ek durumlar oluşturur. Bir tampon eklendikten sonra spektrum değişirse, her şeyi yalnızca pH'a bağlamadan önce tamponun bileşimindeki tuzları ve bağlanmaya yol açabilecek bileşenleri kontrol edin. Kimya ve protonlanma referansı, kimyasal türün kimliğine ilişkin bu soruları burada ele alınan agregasyon sorusundan ayrı tutar.

Beer-Lambert doğrusu neden eğrilir?

Beer-Lambert bağıntısına göre absorbans, absorptivite, derişim ve optik yol uzunluğunun çarpımına eşittir. Bu bir sayma yasasıdır. Sayılan nesnelerin, sayıları değişirken aynı kaldığını varsayar: tek bir absorplayan tür, sabit bir spektrum, derişimle değişen kimyasal süreçlerin bulunmaması, tek renkli ölçüm ışığı, saçılma veya yeniden ışık yayımı olmaması ve ışığın gerçekten belirtilen yolu katetmesi.

Agregasyon ilk varsayımı bozar. Biçimsel olarak toplam absorbans hâlâ türlerin katkılarının toplamıdır: optik yol uzunluğu ile her türün absorptivitesi ve kendi derişiminin çarpımları toplanır. Her tür yasaya uyar. Karışım ise uymaz; çünkü tür derişimleri, toplam boya miktarının doğrusal olmayan fonksiyonlarıdır. Bu nedenle monomer bandındaki absorbansın toplam boya miktarına karşı çizildiği kalibrasyon eğrisi, seyreltik sınırda doğrusal başlar ve derişim yükseldikçe aşağı doğru bükülür; çünkü eklenen her artış, oransal olarak daha az monomer getirir. Dimer bandında ölçülen bir eğri ise ters yönde bükülür. Agregasyon çalışmaları, gözlenen Lambert-Beer sapmalarının kaynağı olarak tam da bu mekanizmayı gösterir. Eğri bölgeye bir doğru uydurup bunu ekstrapole etmek, yaygın hatadır. Doğru, yalnızca oluşturulduğu aralıkta ve matriste geçerlidir.

Seyreltme de benzer bir tuzak oluşturur. Derişik bir stok çözeltiyi cihazın ölçüm aralığına getirmek için seyreltmek, türlerin oranını korumaz. Küvetteki seyreltilmiş çözelti monomere doğru yeniden dengelenir; dolayısıyla spektrumu seyreltilmiş numuneyi doğru tanımlar, ancak stok çözeltiyi yanlış tanımlar. Absorbansları yukarı ölçekleyerek stok çözeltinin spektrumunu geriye doğru hesaplamak, toplam içerik tahminini yalnızca kalibrasyon bu kaymayı zaten hesaba katıyorsa geri kazandırır. Başlangıçtaki bant biçimini ise hiçbir zaman geri kazandırmaz. Bir konsantrenin spektrumunu seyreltik bir referansla karşılaştıran kişi, iki farklı karışımı karşılaştırmaktadır.

Optik yol uzunluğu sonucun bir parçasıdır

Absorbans, ışığın numune içinde katettiği mesafeyle orantılıdır. Aynı çözeltiyi içeren 10 mm'lik bir küvet, 1 mm'lik bir küvetin on katı absorbans verir. Bu ölçekleme yalnızca aynı çözelti için tam olarak geçerlidir ve agregasyon, bu koşulu belirleyici hâle getirir.

Uygulamada optik yol uzunluğu, geçerli aralıkta kalmak için bir araçtır. Uzun bir yol, çoğunlukla monomer içeren seyreltik çözeltilerde duyarlılık sağlar. Kısa bir yol ise dengeyi yeniden kuracak büyük bir seyreltme adımı olmadan derişik bir numuneyi ölçüm aralığında tutar. Yukarıdaki sayıların dayandığı agregasyon araştırma programında tam olarak bu yaklaşım uygulanmıştır: 1.1 ile 34 mikromolar boya için 1 santimetrelik hücreler, 94 mikromolar ile 3.4 milimolar için ise 0.01 santimetrelik hücreler kullanılmıştır. Mikro hacimli ölçüm kaideleri ve plaka okuyucuları, kısa ve bazen değişken optik yolların yanı sıra katyonik boyanın adsorplanabileceği yüzeylerle kendilerine özgü geometriler ekler. Spektral referansın çözücü ve tuzu bildirmesi gibi, ölçüm değeriyle birlikte optik yolu da bildirin. Optik yol uzunluğu belirtilmeyen bir absorbans, sonuç değildir. Söylentidir.

Ölçüm disiplini bu mekanizmadan doğar. Ölçümden önce numuneleri aynı sıcaklığa dengeleyin. Aynı küvet tipini ve yönelimini, aynı tuz ve tampon ortamını içeren eşleştirilmiş kör numuneleri ve temiz cam malzemeleri kullanın; çünkü metilen mavisi cam ve plastiğe adsorplanır ve boyanmış bir küvet, son derişik numunenin izini taşır. Agregasyon kinetiğinin önemli olduğu durumlarda hazırlamadan sonra gecikmeden ölçüm yapın ve her kalibrasyon eğrisini bilinmeyen numunelerle aynı matriste, aynı optik yol uzunluğunda oluşturun. Görsel kontrollerde gözün iyi bir spektrometre olmadığını unutmayın. Çözelti renginin saflığı ortaya koyup koyamayacağı ayrı bir sorudur ve yanıtı olumsuzdur; agregasyondan kaynaklanan renk tonu kaymaları da bunun nedenlerinden biridir.

Cihazın yanında bulundurulacak bir şema

Aşağıdaki şekil, makaleyi laboratuvar tezgâhında kullanılabilecek tek bir referansta özetler. Üç çözeltide aynı boya bulunur, ancak toplam derişimleri ve tuz ortamları farklıdır. Şematik spektrumları, istiflenme arttıkça uzun dalga boyundaki monomer bandının payını kısa dalga boyundaki dimer bandına bıraktığını gösterir. Koşullar şeklin üzerinde belirtilmiştir; çünkü bunlar olmadan eğriler yeniden kullanılamaz. Belirtilen koşullar altında ölçülmüş bant konumları için spektral referansı kullanın. Boyanın çözeltiye girdikten sonra hücrelere nasıl geçtiği için indirgenme ve fazlar arası dağılım yoluyla hücreye giriş makalesine bakın. Işık dozunun ve geometrinin fotokimyasal ölçüm sonuçlarını ayrıca nasıl şekillendirdiği için ışığa maruz kalma ve ölçüm geometrisi makalesine bakın.

Akılda tutulacak kuralın iki bölümü vardır. Spektrum, belirtilen koşullar altında küvette bulunan karışımı tanımlar. Bir absorbansı toplam derişime dönüştüren şey, yalnızca aynı koşullar altında oluşturulmuş bir kalibrasyondur.