การย้อมสีด้วยเมทิลีนบลู: วิธีเตรียมตัวอย่างสำหรับกล้องจุลทรรศน์และชุดภาพจริง

การย้อมสีด้วยเมทิลีนบลูช่วยให้แยกแยะลักษณะของเซลล์ที่ปกติมองเห็นได้จาง ๆ ได้ง่ายขึ้นในการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบไบรต์ฟิลด์ ช่วยให้นักเรียนหาตำแหน่งนิวเคลียสของเซลล์กระพุ้งแก้มหรือตรวจดูรูปร่างและการเรียงตัวของจุลินทรีย์ได้ อย่างไรก็ตาม วัตถุสีน้ำเงินเป็นเพียงสิ่งที่สังเกตพบ การระบุชื่อสิ่งมีชีวิต การวัดขนาด และการตัดสินว่าสิ่งนั้นบ่งชี้โรคหรือไม่ เป็นงานที่แยกจากกัน

ภาพปกแสดงหลักการของความเปรียบต่าง ชุดภาพด้านล่างประกอบด้วยภาพถ่ายจริงจากตัวอย่างที่มีการบันทึกข้อมูลไว้โดยแหล่งอิสระ พร้อมข้อมูลแหล่งที่มาต้นฉบับ

เมทิลีนบลูเผยให้เห็นอะไร?

เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมชนิดเบส โดยไอออนที่ให้สีมีประจุบวก ดังที่ OpenStax อธิบายไว้ในหัวข้อการย้อมสีตัวอย่าง สีย้อมชนิดเบสมีปฏิสัมพันธ์กับองค์ประกอบของเซลล์ที่มีประจุลบ และช่วยให้เซลล์โดดเด่นจากพื้นหลังที่สว่างกว่าได้ ในตัวอย่างที่เตรียมอย่างเหมาะสม เมทิลีนบลูช่วยเน้นบริเวณที่มีกรดนิวคลีอิกมากและโครงสร้างอื่น ๆ ที่จับกับสีย้อม

ในการย้อมสีแบบง่าย สีย้อมเพียงชนิดเดียวให้ความเปรียบต่าง ดังนั้น สิ่งมีชีวิตหลายชนิดจึงอาจดูเป็นสีน้ำเงินได้โดยไม่ได้เป็นสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกัน คำถามที่มีประโยชน์ในขั้นแรกจึงเป็นคำถามเชิงพรรณนา เช่น วัตถุมีรูปร่างกลมหรือยาว อยู่เดี่ยว ๆ หรือรวมเป็นกลุ่ม ติดสีสม่ำเสมอหรือเห็นความแตกต่างภายใน? ดูความแตกต่างระหว่างการย้อมสีแบบง่ายกับการย้อมแกรม ก่อนตีความสีว่าเป็นผลการจำแนก

ความเปรียบต่างกับความละเอียดในการแยกแยะเป็นคนละเรื่องกัน ความเปรียบต่างช่วยให้แยกวัตถุออกจากสิ่งรอบข้าง ส่วนความละเอียดในการแยกแยะช่วยแยกรายละเอียดที่อยู่ใกล้กัน ภาพที่เข้มขึ้นไม่ได้รับประกันว่าจะเห็นโครงสร้างแยกจากกันได้มากขึ้น และไม่ใช่ทุกเม็ดสีเข้มที่ควรระบุว่าเป็นออร์แกเนลล์

ตัวอย่างแบบไม่ย้อมสี ตัวอย่างแบบเปียกที่ย้อมสี และสเมียร์

การเตรียมตัวอย่างแบบเปียกโดยไม่ย้อมสี หรือแบบสภาพเดิม ช่วยให้มองเห็นตัวอย่างโดยไม่เติมสีย้อม แม้ว่าการนำตัวอย่างออกจากสภาพแวดล้อมเดิมจะยังทำให้ตัวอย่างเปลี่ยนไปก็ตาม การเตรียมตัวอย่างแบบเปียกที่ย้อมสีเป็นการเติมน้ำยาขณะที่วัสดุยังอยู่ในของเหลวใต้กระจกปิดสไลด์ ส่วนสเมียร์ที่ตรึงสภาพเป็นการแผ่วัสดุบนสไลด์และใช้วิธีตรึงสภาพที่กำหนดก่อนดำเนินการขั้นต่อไป ภาพรวมการเตรียมตัวอย่างของ OpenStax แยกการเตรียมตัวอย่างแบบเปียกออกจากการตรึงสภาพ และอธิบายว่าเหตุใดสิ่งมีชีวิตที่ตรึงสภาพแล้วจึงไม่สามารถแสดงการเคลื่อนไหวหรือเมแทบอลิซึมตามปกติได้อีก

วิธีเตรียมเหล่านี้ตอบคำถามต่างกัน:

สำหรับการเปรียบเทียบในชั้นเรียน ให้บันทึกตัวอย่างที่ไม่ย้อมสีก่อนตรวจดูตัวอย่างอีกชุดที่ย้อมสีตามขั้นตอนการสอน รักษาการให้แสงและการตั้งค่าถ่ายภาพให้เทียบเคียงกันได้ หากถ่ายภาพเซลล์สองเซลล์ที่ต่างกัน ให้บรรยายว่าเป็นภาพตัวอย่าง ไม่ใช่บันทึกก่อนและหลังของเซลล์เดียวกัน

ชุดภาพจุลทรรศน์: ตัวอย่างย้อมสีจริงสามชนิด

ชุดภาพนี้เป็นการคัดเลือกและตีความขึ้นใหม่จากภาพถ่ายจุลทรรศน์สามภาพที่เผยแพร่ภายใต้สัญญาอนุญาตแบบเปิด ผู้สร้างภาพต้นฉบับเป็นผู้ระบุตัวอย่างและสีย้อม เราไม่ได้ตรวจสอบยืนยันตัวอย่างเหล่านั้นอย่างอิสระ ภาพที่นำมาแสดงไม่ได้ครอบตัด และแปลงเป็น WebP แบบไม่สูญเสียข้อมูล โดยไม่มีการเพิ่มรายละเอียดหรือเปลี่ยนสี

ภาพที่ 1: เซลล์กระพุ้งแก้มของมนุษย์

ตัวอย่าง: เซลล์กระพุ้งแก้มของมนุษย์ สีย้อม: เมทิลีนบลู กำลังขยาย: 400× ตามที่ช่างภาพรายงาน แถบมาตราส่วน: ไม่มี; แหล่งที่มาไม่ได้ให้ขนาดพิกเซลที่ผ่านการสอบเทียบ ภาพถ่ายโดย Fritzmann2002, 2017 จาก เซลล์กระพุ้งแก้มของมนุษย์ (ย้อมด้วยเมทิลีนบลู) ภายใต้สัญญาอนุญาต CC BY-SA 4.0 การนำภาพมาแสดงนี้ยังคงใช้สัญญาอนุญาตดังกล่าว

เริ่มจากเซลล์ที่อยู่เดี่ยว ๆ โดยนิวเคลียสที่เข้มกว่าจะแยกจากไซโทพลาซึมสีน้ำเงินรอบข้างได้ง่ายกว่า จากนั้นตรวจดูเซลล์ที่ซ้อนทับกันด้านล่าง การซ้อนทับทำให้ไล่ตามขอบเขตได้ยากขึ้นและอาจทำให้บางบริเวณดูเข้มขึ้น ใช้ภาพนี้ฝึกไล่ตามขอบเซลล์ ไม่ใช่นับทุกปื้นสีเข้มว่าเป็นนิวเคลียส คู่มือการสังเกตเซลล์กระพุ้งแก้ม อธิบายแบบฝึกหัดสำหรับตัวอย่างชนิดนี้เพิ่มเติม

ภาพที่ 2: เซลล์หัวหอม

ตัวอย่าง: เซลล์หัวหอม ตามที่แหล่งที่มาระบุ สีย้อม: เมทิลีนบลู กำลังขยาย: “200x” ปรากฏในชื่อไฟล์ต้นฉบับ; ไม่ได้ผ่านการตรวจสอบยืนยันอย่างอิสระ แถบมาตราส่วน: ไม่มี; ไม่ได้ให้ข้อมูลการสอบเทียบ ภาพถ่ายโดย Alvy16, 2019 จาก เซลล์หัวหอม 200x ภายใต้สัญญาอนุญาต CC BY 4.0

ช่องเซลล์รูปยาวเรียงตัวเป็นแผ่นอย่างเป็นระเบียบ เปรียบเทียบแนวขอบยาวที่เซลล์ใช้ร่วมกันกับขอบรูปร่างไม่สม่ำเสมอในภาพที่ 1 สังเกตวัสดุสีเข้มที่เห็นเด่นชัดและความสว่างในพื้นที่ภาพที่ไม่สม่ำเสมอด้วย ภาพถ่ายนี้ไม่ได้ยืนยันว่าสิ่งสะสมสีเข้มทุกจุดคืออะไร แต่แสดงให้เห็นว่าเหตุใดบันทึกการสังเกตที่มีประโยชน์จึงควรรวมสิ่งแปลกปลอมจากการเตรียมหรือถ่ายภาพและความไม่แน่นอนไว้ด้วย แทนที่จะระบุชื่อให้ทุกสิ่งที่ติดสี

ภาพที่ 3: ยีสต์ที่แหล่งที่มาระบุว่าเป็น Candida spp.

ตัวอย่าง: Candida spp. ตามที่ช่างภาพระบุ สีย้อม: การย้อมสีแบบบวกอย่างง่ายด้วยเมทิลีนบลู กำลังขยาย: ไม่มีข้อมูล แถบมาตราส่วน: ไม่มี; ไม่ได้ให้ขนาดพิกเซลที่ผ่านการสอบเทียบ ภาพถ่ายโดย Marta ผู้ใช้ Wikimedia ชื่อ Martunia.g, 2021 จาก การย้อมสีแบบบวกด้วยเมทิลีนบลู 2 ภายใต้สัญญาอนุญาต CC BY 4.0

เปรียบเทียบกลุ่มสีน้ำเงินที่หนาแน่นกับบริเวณขอบที่มีวัตถุน้อยกว่า ขอบของแต่ละวัตถุจะไล่ตามได้ง่ายขึ้นในบริเวณที่ซ้อนทับกันน้อยกว่า ชื่อ Candida มาจากบันทึกของแหล่งที่มา ไม่ใช่จากการระบุชนิดโดยใช้ภาพถ่ายนี้ ภาพนี้ยังไม่ได้ให้ผลการประเมินความมีชีวิตด้วย การทดสอบความมีชีวิตและการหายใจของยีสต์ ต้องมีเงื่อนไข ชุดควบคุม และการตีความเฉพาะของการทดสอบนั้น

การอ่านมาตราส่วนอย่างถูกต้อง

ภาพเหล่านี้ใช้เปรียบเทียบลักษณะที่มองเห็นได้ ไม่ใช่ใช้วัดขนาดเป็นไมโครเมตรหรือเปรียบเทียบขนาดเซลล์จริงระหว่างภาพ กำลังขยายที่รายงานไม่สามารถทดแทนข้อมูลการสอบเทียบกล้องที่ขาดหายไปได้ การเปลี่ยนขนาดแสดงผลของภาพทำให้ระดับการขยายที่เห็นเปลี่ยนไป

สำหรับภาพของคุณเอง ให้สอบเทียบการวัดโดยใช้มาตรฐานที่ทราบค่าและชุดระบบทางแสงที่เกี่ยวข้อง คู่มือการวัดด้วยไมโครมิเตอร์ของ Nikon อธิบายว่าไมโครมิเตอร์สำหรับแท่นวางตัวอย่างช่วยแปลงช่องแบ่งในภาพหรือสเกลเล็งที่ยังไม่มีค่าความยาวกำกับให้เป็นความยาวจริงได้อย่างไร บันทึกเลนส์ใกล้วัตถุ การจัดระบบกล้อง และการสอบเทียบ แล้วเพิ่มแถบมาตราส่วนจากข้อมูลเหล่านั้น อย่าอนุมานแถบมาตราส่วนจากขนาดเซลล์เฉลี่ยในตำรา

น้ำยาในขวดตรงกับวิธีที่ใช้หรือไม่?

ขวดที่ติดฉลากว่าเมทิลีนบลูไม่ได้ให้ข้อกำหนดสำหรับการใช้งานในห้องปฏิบัติการอย่างครบถ้วน ตรวจสอบความเข้มข้นและหน่วย ตัวทำละลาย ส่วนผสมเพิ่มเติม วัตถุประสงค์การใช้งาน เอกสารประจำรุ่นการผลิต และคำแนะนำ เอกสารข้อมูลความปลอดภัยของสารเคมีอธิบายอันตราย ส่วนคำแนะนำของวิธีกำหนดว่าจะใช้น้ำยากับการเตรียมตัวอย่างที่ต้องการอย่างไร

ตัวอย่างที่ชัดเจนคือสารละลายเมทิลีนบลูสูตร Löffler ของ Merck ผู้ผลิตระบุว่าเป็นน้ำยาสำหรับงานกล้องจุลทรรศน์ และอธิบายบทบาทของน้ำยาในฐานะสีย้อมแทรกในการย้อมสีทนกรด ข้อมูลการติดไฟที่ระบุไว้ยังแสดงให้เห็นว่าเหตุใดคำว่า “ของเหลวสีน้ำเงิน” จึงไม่เพียงพอสำหรับวางแผนการจัดการหรือการให้ความร้อน คุณสมบัติเหล่านี้ใช้กับสูตรนั้น ไม่ได้ใช้กับสารละลายเมทิลีนบลูในน้ำทุกชนิดโดยอัตโนมัติ

ในทำนองเดียวกัน วุ้นอีโอซินเมทิลีนบลู เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสูตรส่วนประกอบ ไม่ใช่น้ำยาย้อมสไลด์ที่ทำโดยเติมเมทิลีนบลูอย่างเดียวลงในตัวอย่าง สำหรับวัตถุประสงค์การถ่ายภาพที่ต่างออกไป ให้เปรียบเทียบทางเลือกแทนเมทิลีนบลูสำหรับงานกล้องจุลทรรศน์

สำหรับชุดกล้องจุลทรรศน์สำหรับผู้เริ่มต้น ให้เริ่มจากวิธีการเรียนรู้ที่มีเอกสารกำกับ สไลด์สำเร็จรูปที่ทราบข้อมูล และน้ำยาที่ระบุไว้ หากฉลากบนขวดสูญหายหรือไม่สามารถยืนยันส่วนประกอบได้ ให้เปลี่ยนเป็นน้ำยาที่เหมาะสมและมีเอกสารกำกับ ใช้อุปกรณ์ป้องกันดวงตาและปฏิบัติตามคำแนะนำการจัดการที่ให้มาสำหรับสูตรที่ใช้จริง วัสดุจากมนุษย์และตัวอย่างจากสิ่งแวดล้อมที่ไม่ทราบชนิดต้องปฏิบัติตามขั้นตอนการจัดการและกำจัดตัวอย่างของห้องปฏิบัติการเพื่อการเรียนการสอน การย้อมสีไม่สามารถทดแทนขั้นตอนเหล่านั้นได้

เขียนสิ่งที่สังเกตพบก่อนข้อสรุป

“วัตถุรูปไข่สีน้ำเงินที่รวมกันเป็นกลุ่ม” เป็นคำบรรยายภาพที่มีหลักฐานรองรับ ส่วน “การติดเชื้อชนิดหนึ่ง” ต้องอาศัยหลักฐานที่ภาพนี้ไม่ได้ให้ไว้ ในสมุดบันทึก ให้แยกแหล่งที่มาของตัวอย่าง การเตรียม ปฏิกิริยาการย้อมสี และวิธีระบุชนิดออกจากกัน ความแตกต่างนี้ทำให้ภาพง่าย ๆ ในชั้นเรียนมีประโยชน์ และป้องกันไม่ให้ภาพถ่ายจุลทรรศน์ที่สวยงามถูกใช้รองรับข้อกล่าวอ้างที่ภาพนั้นยืนยันไม่ได้