เมทิลีนบลูเข้าสู่เซลล์ได้อย่างไร: การรีดักชัน การออกซิเดชันกลับ และการแบ่งส่วนในเยื่อหุ้มเซลล์

เมื่อสังเกตเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดในจานเพาะเลี้ยงรับเมทิลีนบลูเข้าสู่เซลล์ การตีความที่ดูชัดเจนที่สุดกลับเป็นการตีความที่ผิด อาหารเลี้ยงเซลล์สูญเสียสีน้ำเงิน ขณะที่เซลล์มีเม็ดสีน้ำเงินเพิ่มขึ้น จึงดูเหมือนว่าสีย้อมต้องผ่านเยื่อหุ้มเข้าไปในรูปโมเลกุลสีน้ำเงิน แต่การทดลองบอกอีกอย่างหนึ่ง รูปสีน้ำเงินแทบไม่ผ่านเยื่อหุ้ม สิ่งที่ผ่านเข้าไปคือรูปไม่มีสี ส่วนสีน้ำเงินที่เห็นภายในนั้นเกิดขึ้นภายในเซลล์ หลังจากสารเข้าไปแล้ว

กลไกที่สวนทางกับภาพที่เห็นนี้สำคัญ เพราะเป็นตัวกำหนดว่าการติดสีบอกอะไรได้และบอกอะไรไม่ได้ เม็ดสีน้ำเงินบ่งชี้ถึงสีย้อมรูปออกซิไดซ์ที่ผ่านการออกซิเดชันกลับและถูกกักไว้ในออร์แกเนลล์ แต่ไม่ได้บ่งชี้ปริมาณสีย้อมทั้งหมดในเซลล์ ไม่ได้บ่งชี้ปริมาณสารในรูปรีดิวซ์ และไม่ได้วัดผลทางชีวภาพ หากต้องการเข้าใจเหตุผล ให้ติดตามสามขั้นตอนนี้: การรีดักชันที่ผิวเซลล์ การแพร่ของรูปรีดิวซ์ และการออกซิเดชันกลับพร้อมการกักไว้ภายใน

สองรูปนี้มีพฤติกรรมเหมือนเป็นคนละโมเลกุล

เมทิลีนบลูรูปออกซิไดซ์มีโครงสร้างวงแหวนแบนราบที่มีประจุบวก ละลายในน้ำ ดูดกลืนแสงอย่างมากในช่วงประมาณ 600 ถึง 700 nanometers และมีสีน้ำเงิน ประเด็นสำคัญอยู่ที่ประจุ โมเลกุลที่มีประจุและชอบน้ำไม่สามารถผ่านเยื่อหุ้มลิพิดได้ง่าย ดังนั้นคำที่ใช้กันอย่างระมัดระวังในวรรณกรรมวิชาการจึงเป็น “ผ่านเยื่อหุ้มได้ค่อนข้างยาก” ไม่ใช่ “ผ่านเยื่อหุ้มไม่ได้”

เมทิลีนบลูรูปรีดิวซ์ ซึ่งเรียกว่าลิวโคเมทิลีนบลู ไม่มีสี ไม่มีประจุ และละลายในไขมัน เมื่อเอาประจุออก เยื่อหุ้มก็ไม่เป็นกำแพงอีกต่อไป โมเลกุลรูปรีดิวซ์แพร่ผ่านได้ง่าย และเมื่อเข้าไปอยู่ในช่องภายในเซลล์ที่มีสภาวะออกซิไดซ์มากกว่า ก็สามารถสูญเสียอิเล็กตรอนอีกครั้งและกลับเป็นรูปสีน้ำเงินที่มีประจุและถูกกักไว้ ดังนั้น เคมีรีดอกซ์ของสีย้อม จึงเป็นกลไกการขนส่งของมันด้วย เมื่อเปลี่ยนจำนวนอิเล็กตรอน ความสามารถในการผ่านเยื่อหุ้มก็เปลี่ยนไป

อิเล็กตรอนสำหรับขั้นตอนแรกมาจากตัวเซลล์เอง เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีการขนส่งอิเล็กตรอนผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ โดยส่งสมมูลรีดิวซ์จากตัวให้อิเล็กตรอนภายในเซลล์ออกไปยังตัวรับที่ผิวเซลล์ กิจกรรมที่เกิดข้ามเยื่อหุ้มเซลล์นี้เป็นหน้าที่ปกติของเซลล์ พบได้ในเซลล์ส่วนใหญ่ และเอนไซม์รีดักเทสที่ผิวเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดซึ่งทำหน้าที่กับสีย้อมไทอาซีนก็มีพฤติกรรมเหมือนเอนไซม์อื่น ๆ ในประเด็นหนึ่งที่สำคัญมาก: มันยังคงทำงานได้เมื่อมีไซยาไนด์และเอไซด์ในระดับที่หยุดขั้นตอนถัดไปได้ ความแตกต่างนี้คือจุดสำคัญที่เชื่อมโยงเรื่องทั้งหมดเข้าด้วยกัน

แนวคิดเรื่องการแบ่งส่วนมาก่อน และเกือบอธิบายการรับเข้าสู่เซลล์ได้

ในปี 1929 มาเรียน เออร์วิน แห่งสถาบันร็อกกีเฟลเลอร์ ตั้งคำถามที่เรียบง่ายกว่า บางทีการที่สีย้อมเข้าสู่เซลล์อาจเป็นเพียงการแบ่งส่วนระหว่างน้ำกับชั้นไขมันของเซลล์ และชั้นคลอโรฟอร์มอาจใช้แทนชั้นไขมันเหล่านั้นในการทดลองได้ การศึกษาการแทรกผ่านด้วยสเปกโทรโฟโตเมตรี ของเธอใช้การเขย่าสารละลายสีย้อมในน้ำร่วมกับคลอโรฟอร์ม แล้วเปรียบเทียบสิ่งที่ย้ายเข้าสู่เฟสอินทรีย์กับสิ่งที่เข้าสู่เซลล์สาหร่ายที่มีชีวิต

ข้อค้นพบสองประการจากงานนั้นยังคงควรค่าแก่การพิจารณา ประการแรก สารละลายเมทิลีนบลูเชิงพาณิชย์มีไตรเมทิลไทโอนีน ซึ่งปัจจุบันเรียกว่า azure B ปะปนอยู่ และสิ่งเจือปนนี้แทรกผ่านได้เร็วกว่าเมทิลีนบลูเอง โดยเฉพาะเมื่อ pH เป็นด่าง ซึ่งรูปเบสอิสระที่ละลายในลิพิดมีสัดส่วนมากที่สุด การเข้าสู่เซลล์บางส่วนที่ดูเหมือนเป็นเมทิลีนบลู แท้จริงแล้วเป็นการเข้าสู่เซลล์อย่างเลือกจำเพาะของ azure B ประการที่สอง pH กำหนดผลลัพธ์โดยกำหนดสถานะการแตกตัวเป็นไอออน และเซลล์ที่เสียหายยอมให้สีย้อมเข้าไปได้มากกว่าเซลล์ที่สมบูรณ์อย่างมาก สัมประสิทธิ์การแบ่งส่วนและสถานะประจุเป็นตัวกำหนดว่าทั้งระบบจำลองและเซลล์ที่มีชีวิตจะรับอะไรเข้าไป และความคล้ายคลึงระหว่างสองระบบนี้ก็สนับสนุนแนวคิดว่ามีชั้นที่ไม่ใช่น้ำอยู่ในขอบเขตของเซลล์

แบบจำลองนี้คาดการณ์เรื่องลิพิดและการแตกตัวเป็นไอออนได้อย่างเฉียบคม แต่ไม่สามารถแยกแยะระหว่างสีย้อมที่แบ่งส่วนในรูปเดิม กับสีย้อมที่ถูกเปลี่ยนรูปทางเคมีที่ผิวเซลล์ ผ่านเข้าไปในอีกรูปหนึ่ง แล้วถูกเปลี่ยนกลับภายในเซลล์ได้ การแยกแยะเช่นนี้ต้องอาศัยการทดลองที่ต่างออกไป ซึ่งเกิดขึ้นอีกเจ็ดสิบปีต่อมาในเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดของปอด

รีดักชันภายนอก กักไว้ภายใน

เมอร์เกอร์และคณะทำงานกับเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดแดงปอดของโคที่เพาะเลี้ยง และเสนอขั้นตอนสามขั้น: สีย้อมรูปออกซิไดซ์ถูกรีดิวซ์ที่ผิวเซลล์ให้เป็นรูปไม่มีสีที่ชอบลิพิด รูปรีดิวซ์แพร่เข้าไป และการออกซิเดชันกลับภายในเซลล์ทำให้เกิดรูปออกซิไดซ์ที่ผ่านเยื่อหุ้มไม่ได้ขึ้นอีกครั้ง จึงสะสมอยู่ภายใน จากนั้น การศึกษาการรับสีย้อมไทอาซีนเข้าสู่เซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือด ของพวกเขาทดสอบลำดับนี้ โดยพยายามขัดขวางมันในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจง

เครื่องมือแรกคือเฟอร์ริไซยาไนด์ ซึ่งเป็นตัวรับอิเล็กตรอนที่เข้าสู่เซลล์ไม่ได้ เมื่อเอนไซม์ที่ผิวเซลล์รีดิวซ์สีย้อมสีน้ำเงินให้เป็นรูปไม่มีสีภายนอกเซลล์ เฟอร์ริไซยาไนด์สามารถดึงอิเล็กตรอนเหล่านั้นกลับไป ทำให้สีย้อมกลับเป็นสีน้ำเงินในอาหารเลี้ยงเซลล์ก่อนที่จะผ่านเข้าไป ตราบใดที่มีเฟอร์ริไซยาไนด์มากเกินพอ (สีย้อม 10 micromolar เทียบกับเฟอร์ริไซยาไนด์ 50 ถึง 500 micromolar) การรับสีย้อมเข้าสู่เซลล์แทบหยุดลง และจะกลับมามีอัตราปกติก็ต่อเมื่อเฟอร์ริไซยาไนด์ถูกใช้หมดแล้ว ข้อมูลจลนพลศาสตร์บอกเรื่องเดียวกันในอีกทางหนึ่ง เฟอร์ริไซยาไนด์ลดลงด้วยอัตราที่ค่อนข้างคงที่ สอดคล้องกับฟลักซ์การรีดักชันที่ผิวเซลล์อย่างต่อเนื่องซึ่งส่งอิเล็กตรอนให้ตัวกลางที่หมุนเวียนกลับมาใช้ได้ ขณะที่สีย้อมภายนอกเซลล์ลดลงแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลเมื่อปริมาณที่มีอยู่ค่อย ๆ หมดไป ฟลักซ์ที่คงที่ควบคู่กับปริมาณสารที่ลดลงหมายความว่า สัญญาณของเฟอร์ริไซยาไนด์บ่งชี้การรีดักชันอย่างต่อเนื่อง ไม่ใช่การที่โมเลกุลสีย้อมออกจากสารละลาย

เครื่องมือที่สองตัดขั้นตอนการผ่านเยื่อหุ้มออกไปทั้งหมด ทีมวิจัยเชื่อมโทลูอิดีนบลู O ซึ่งเป็นสีย้อมไทอาซีนที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกัน เข้ากับสายพอลิอะคริลาไมด์ขนาดใหญ่ที่ใหญ่เกินกว่าจะเข้าสู่เซลล์ได้ ไม่ว่าจะอยู่ในสถานะออกซิเดชันใด เซลล์ยังคงรีดิวซ์สีย้อมที่ถูกตรึงไว้นี้ได้ ดังนั้นการรีดักชันจึงไม่จำเป็นต้องเข้าถึงภายในเซลล์ กลไกที่ทำหน้าที่นี้อยู่บนผิวเซลล์หรือเชื่อมโยงกับผิวเซลล์ทางไฟฟ้า

จากนั้นจึงมาถึงการแยกขั้นตอนที่เป็นที่มาของชื่อบทความวิจัย ไซยาไนด์และเอไซด์ที่ 2 millimolar ยับยั้งการสะสมสีย้อมอย่างมาก และเมื่อดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ กลุ่มสะสมสีน้ำเงินเข้มและสีม่วงที่ปกติล้อมรอบนิวเคลียสแทบหายไป แต่สารยับยั้งทั้งสองไม่ได้ทำให้การรีดักชันภายนอกเซลล์ช้าลง: การหมุนเวียนของเฟอร์ริไซยาไนด์ยังคงดำเนินต่อไปโดยไม่ลดลง และพอลิเมอร์ที่ผ่านเยื่อหุ้มไม่ได้ก็ยังถูกรีดิวซ์ จุดที่ถูกขัดขวางจึงอยู่ในขั้นตอนถัดไป ไซยาไนด์และเอไซด์หยุดการออกซิเดชันกลับและการกักเก็บภายในเซลล์ ไม่ใช่การรีดักชันที่ผิวเซลล์ การทดสอบควบคุมความมีชีวิตของเซลล์สนับสนุนการตีความนี้ เพราะเซลล์ยังคงรักษาเอนไซม์แลคเตตดีไฮโดรจีเนส ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ในไซโทซอล ไว้ได้ตลอดการทดลองเหล่านี้ ดังนั้นการสูญเสียความสามารถในการรับสารเข้าสู่เซลล์จึงไม่ได้เกิดจากความเป็นพิษหรือการแตกของเยื่อหุ้มเพียงอย่างเดียว

ข้อควรระวังประการหนึ่งจากบทความวิจัยนี้ยังคงใช้ได้ กลุ่มสะสมสีน้ำเงินอยู่รอบนิวเคลียส แต่ไม่ได้อยู่ภายในนิวเคลียส ซึ่งสอดคล้องกับการเกิดออกซิเดชันภายในออร์แกเนลล์ของเซลล์ อย่างไรก็ตาม การศึกษานี้ไม่ได้ระบุว่าเป็นออร์แกเนลล์ชนิดใด รูปแบบคล้ายกันในเซลล์ชนิดอื่นเคยถูกระบุว่าอยู่ในไลโซโซมทั้งที่มีหลักฐานเพียงเล็กน้อย จึงควรถือว่าการกักไว้เป็นข้อสรุปที่ยืนยันแล้ว แต่ตำแหน่งที่กักยังเป็นข้อสรุปเบื้องต้น ผู้อ่านที่ติดตามว่าอิเล็กตรอนไปที่ใดต่อ สามารถอ่านต่อเรื่อง การขนส่งอิเล็กตรอนในไมโทคอนเดรียและการจัดการรีดอกซ์ และภาพรวมที่กว้างขึ้นของ การดูดซึมและการกระจายตามเส้นทางเข้าสู่ร่างกาย

การติดสีไม่ใช่ระดับการสัมผัสสาร

การศึกษาชุดที่สามแสดงให้เห็นว่าเกิดอะไรขึ้นเมื่อกลไกการรับสารเข้าสู่เซลล์นี้ถูกเชื่อมโยงกับตัวชี้วัดทางชีวภาพ สกอตต์และคณะพบว่าเมทิลเบตาไซโคลเดกซ์ทริน ซึ่งเป็นน้ำตาลรูปวงแหวนคล้ายโดนัท จับกับเมทิลีนบลูโดยตรง โดยมีค่าคงที่การรวมตัวประมาณ 310 per molar สำหรับสารเชิงซ้อนแบบสอดแทรก เทียบกับประมาณ 5846 per molar สำหรับการเกิดไดเมอร์ของสีย้อม ในเซลล์ไฟโบรบลาสต์ L929 การจับนี้ ขัดขวางทั้งการติดสีของเซลล์และการกระตุ้นการรับกลูโคส: การบ่มกับไซโคลเดกซ์ทรินล่วงหน้าป้องกันการติดสีน้ำเงิน และการเติมภายหลังเร่งการสูญเสียสี เมื่อสัญญาณสีน้ำเงินที่ตรวจวัดทางแสงลดลงจากเซลล์ การขนส่งกลูโคสที่ถูกกระตุ้นก็ลดลงอย่างสอดคล้องกันอย่างใกล้ชิด

ผู้เขียนตีความความสัมพันธ์นี้ว่าสนับสนุนการมีปฏิสัมพันธ์โดยตรงระหว่างสีย้อมกับโปรตีนในวิถีกระตุ้นตัวขนส่งกลูโคส มากกว่ากลไกความเครียดออกซิเดชันที่คงอยู่นาน ข้ออนุมานนี้สมเหตุสมผล แต่มีขอบเขตจำกัด การทดลองไม่ได้ระบุว่าเป็นโปรตีนใด ไม่ได้แสดงการจับกับตัวขนส่งโดยตรง และความสัมพันธ์ระหว่างการสูญเสียสีกับการลดลงของผลที่เกิดขึ้นก็ไม่สามารถตัดกลไกที่อาศัยรีดอกซ์ออกได้ทุกเส้นทาง

บทเรียนที่ยังคงใช้ได้คือเรื่องการวัด การติดสีที่ตรวจวัดทางแสงบ่งชี้สีย้อมรูปออกซิไดซ์ที่มองเห็นได้และเกี่ยวข้องกับเซลล์ แต่ตรวจไม่พบปริมาณสารรูปรีดิวซ์ที่ไม่มีสีเลย ดังนั้นเซลล์ที่มีสีจางอาจยังมีสารที่เทียบเท่ากับสีย้อมอยู่ และเซลล์ที่ติดสีเข้มก็บ่งชี้สีย้อมรูปออกซิไดซ์ที่ถูกกักไว้ ไม่ใช่ระดับการสัมผัสสารทั้งหมดของเนื้อเยื่อหรือขนาดของผลที่เกิดขึ้น ข้อควรระวังเดียวกันนี้ใช้ได้ในระดับที่กว้างขึ้นด้วย: การเปรียบเทียบการติดสีระหว่างเซลล์ต่างชนิด หรือการถือว่าชิ้นเนื้อที่ติดสีเข้มเป็นหลักฐานของการสัมผัสสารที่สูงกว่า เป็นการทำซ้ำข้อผิดพลาดแรกจากการสังเกตจานเพาะเลี้ยง การรับสารเข้าสู่เซลล์เป็นวัฏจักรของการรีดักชัน การแพร่ และการออกซิเดชันกลับ และภาพของรูปสีน้ำเงิน ณ เวลาใดเวลาหนึ่งเห็นเพียงส่วนเดียวของวัฏจักรนี้ ผลในทางปฏิบัติต่อ การย้อมสีและการจัดการสารในห้องปฏิบัติการ รวมถึงการตีความข้อกล่าวอ้างเกี่ยวกับปริมาณสารและระดับการสัมผัสสาร จึงเป็นผลสืบเนื่องโดยตรงจากกลไกนี้