Таҷрибаҳое, ки кабуди метилениро бо нафаскашии ҳуҷайравӣ пайвастанд

Хуни аз фибрин тозашудаи инсон, ки се соат дар 37 °C нигоҳ дошта мешавад, тақрибан ду дарсади оксигени дар таркибаш бударо истеъмол мекунад. Агар пеш аз инкубатсия миқдори ками кабуди метиленӣ илова шавад, ҳамон хун тақрибан шасту панҷ дарсадро истеъмол мекунад. Дар худи ҳуҷайраҳо чизе тағйир наёфт. Танҳо маҳлул тағйир ёфт.

Ин рақам аз мақолаи соли 1928-и Ҷорҷ Ҳарроп ва Э. С. Гузман Баррон дар Ҷонс Ҳопкинс гирифта шудааст ва сарчашмаи иддаои бисёр такроршаванда аст, ки кабуди метиленӣ нафаскашии ҳуҷайравиро беҳтар мекунад. Ин иддао нодуруст нест, аммо маънояш аз он чизе, ки ба гӯш мерасад, маҳдудтар аст.

Рақами ҷадвал воқеан чиро чен мекунад

Нишондиҳандаи ниҳоӣ ҷаббиши оксиген буд, ки бо таҳлили газ муайян мешуд. Ҳарроп ва Баррон хуни навгирифтаро дар 10 °C аз пахта мегузаронданд, то ҳуҷайраҳои сафедро хориҷ кунанд, намунаро бо оксиген сер мекарданд, онро ба ду қисм ҷудо мекарданд, ба як қисм ранг илова мекарданд ва ҳар дуро пас аз инкубатсия таҳлил менамуданд. Шумораи лейкоситҳо хеле кам аз тақрибан ҳазор дар як миллиметри мукааб зиёд мешуд. Истеъмоли оксиген ҳамчун ҳиссаи оксигени ибтидоии намуна, ки нопадид шуда буд, гузориш мешуд.

Онҳо диоксиди карбонро ҳам чен карданд, вале дар ин маврид худи усул монеа эҷод кард. Хуни аз фибрин тозашуда дар соати аввали инкубатсия бо сабабҳои ба реаксияи таҳқиқшаванда вобастанабуда то ду миллимол диоксиди карбон ба ҳар 100 mL ҷудо мекард. Аз ин рӯ, коэффисиентҳои нафаскашии аз хуни пурра гирифташуда қобили истифода набуданд. Танҳо ҳуҷайраҳои шуста дар маҳлули Локк рақамҳои қобили тафсир доданд ва онҳо ҳам бо ранг ва ҳам бе он дар ҳудуди 0.73 то 0.80 ҷой доштанд.

Ин ҷузъиёти беаҳамият нест. «Нафаскашӣ» дар ин мақолаҳо мубодилаи газ дар зарфи пӯшидаро ифода мекунад. Фосилаи байни истеъмоли оксиген ва ҳосили энергияи муфид дар мақолаи истеъмоли оксиген дар бораи ATP чӣ мегӯяд ва чӣ намегӯяд алоҳида баррасӣ мешавад.

Ранг бештар ба ҳуҷайраҳое таъсир кард, ки камтар нафас мекашиданд

Эритроситҳои болиғи ширхӯрон қариб ҳеҷ истеъмоли ченшавандаи оксиген надоранд. Эритроситҳои ядродори парандаҳо онро доранд. Ҳарроп ва Баррон ҳар ду навъро санҷиданд ва ин фарқ асоси далели онҳо шуд.

Дар намунаҳои ширхӯрон ранг истеъмолро аз бист то панҷоҳ маротиба зиёд кард. Дар хуни қоз, ки ҳуҷайраҳояш аллакай нафас мекашиданд, суръат ҳеҷ гоҳ бештар аз ду баробар нашуд. Ҳар қадар нафаскашии ибтидоӣ баландтар буд, ранг ҳамон қадар камтар метавонист онро зиёд кунад.

Ҳамин қонуният дар дохили як намуд низ дида мешавад. Намунаи хуни бемори гирифтори полиситемияи ҳақиқӣ, ки ҳуҷайраҳои ноболиғ дошт, бе ранг 11.3 дарсади оксигенашро истеъмол кард, дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои шустаи донори солим 2.8 дарсадро истеъмол карданд. Ранг онро танҳо то 63.4 дарсад расонд: суръат шаш баробар афзуд, дар ҳоле ки дар ҳуҷайраҳои муқаррарӣ он қариб сӣ баробар зиёд шуд. Ранг рафтори ҳуҷайраҳои болиғро ба рафтори ҳуҷайраҳои ноболиғ наздик мекард — маҳз ҳаминро муаллифон таъсири он медонистанд.

Сианид бояд онро бозмедошт

Маълум буд, ки сианид оксидшавии ҳуҷайравиро бозмедорад. Бо вуҷуди ин, Ҳарроп ва Баррон онро ҳамроҳи ранг илова карданд.

Натиҷаҳои хуни гов намунаи хос мебошанд. Бе ҳеҷ илова миқдори оксиген дар давоми се соат аз 22.61 то 22.03 дарсади ҳаҷмӣ коҳиш ёфт. Бо кабуди метиленӣ он то 12.84 поён рафт. Бо кабуди метиленӣ ва сианиди калий бо консентратсияи як панҷҳазорум молярӣ он то 12.74 коҳиш ёфт. Таъсири ранг амалан бетағйир монд.

Расм: сабти пайвастаи микронафаскашии эритроситҳои инсон. Тирча вақти илова кардани кабуди метилениро нишон медиҳад. Пеш аз он хат қариб ҳамвор аст; баъд аз он пайваста боло меравад. Бознашр аз Ҳарроп ва Баррон, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Хулосаи онҳо ин буд, ки ранг ҳамчун интиқолдиҳандаи оксиген амал мекунад ва «моддаеро таъмин менамояд, ки аз эритроситҳои беядрои ширхӯрони болиғ нопадид шудааст». Ду сол баъд Михаэлис ва Саломон дар Институти Рокфеллер ихтилофро ба шакле баён карданд, ки то имрӯз боқӣ мондааст. Ё таъсири ранг «хосияти тасодуфии ранг» буд, ё ранг «намунаи ягон моддаи номаълум дар организмҳо» буд. Ин ду эҳтимол ҳанӯз ҳал нашудаанд. Он чизе, ки тағйир ёфтааст, имкони хеле дақиқтар тавсиф кардани ҳуҷайраҳост.

Усораи ҷигар ҳамон таъсирро дошт

Михаэлис ва Саломон нишон доданд, ки усораҳои узвҳо, ки бо оби сард гирифта мешаванд, ҳамон афзоиши фаъолиятро ба вуҷуд меоранд. Усораи ҷигари калламуш таъсири аз ҳама қавӣ дошт; баъд аз он гурда, испурч ва хоя меистоданд. Мағзи сар, мушак ва зардоби хун таъсири кам доштанд ё тамоман таъсир надоштанд.

Сипас онҳо усораро дар ҳузури моноксиди карбон санҷиданд. Нафаскашии аз усора ё ранг ба вуҷудомада дар омехтаи 98 дарсад моноксиди карбон ва 2 дарсад оксиген бетағйир монд. Ҳамин омехтаи газ нафаскашии хамиртуруш ва эритроситҳои ядродори мурғро тақрибан аз 60 то 80 дарсад бозмедошт, ки бо тавсифи Варбург аз ферменти нафаскашии ҳассос ба моноксиди карбон мувофиқ буд. Пас, моддаи номаълуми бофта ферменти Варбург набуд.

Дар ҷараёни таҳқиқ чанд номзади эҳтимолӣ рад шуданд. Глутатиони барқароршуда ва систеин танҳо ҳамон қадар истеъмоли оксигенро ба вуҷуд оварданд, ки барои оксидшавии худи онҳо лозим буд. Коэнзими Ҳарден ва Янг рад шуд, зеро мушак аз ҳама бештар онро дорад, вале қариб камтарин таъсирро нишон дод. Ситохроми Кейлин, ки чанд сол пеш номгузорӣ шуда буд, бо ҳамон зиддият рӯ ба рӯ шуд. Пешниҳоди худи онҳоро, ки моддаи фаъол аз ядрои ҳуҷайра меояд, онҳо танҳо як фарзия номиданд.

Таъсир ба шароит вобаста буд

Ҳуҷайраҳо бояд солим мемонданд. Гемолиз бо оби дистиллшуда ё яхкунонии такрорӣ ҷавоб ба ранг ва усораро пурра аз байн мебурд; гемолизи қисман онро мутаносибан кам мекард.

Қанд низ зарур буд. Глюкоза, фруктоза ва сахароза нафаскашии аз ранг ба вуҷудомадаро дастгирӣ мекарданд; маннитол чунин таъсир надошт. Бе қанд тамоман нафаскашӣ набуд ва чунин менамуд, ки ранг дар ин раванд ба ҳуҷайраҳо осеб мерасонад. Аз ин рӯ, глюкозае, ки як ё ду соат баъд илова мешуд, нафаскаширо барқарор намекард. Муаллифон тахмин карданд, ки ранг як ҷузъи сохтории барои ҳуҷайра заруриро оксид мекунад.

Рӯшноӣ таъсири рангро хеле зиёд мекард, ҳарчанд таъсир дар торикӣ ҳам равшан буд. Рангҳои дигари барқароршаванда рафтори дигар доштанд: кабуди толуиленӣ ба кабуди метиленӣ баробар буд ё аз он бартарӣ дошт, дар ҳоле ки дисулфонати индиго қариб ҳеҷ таъсире надошт. Байни потенсиали оксидшавию барқароршавии ранг ва андозаи таъсири он робитаи возеҳ пайдо нашуд. Муаллифон инро ба гузарониши мембрана ва заҳрнокӣ нисбат доданд.

Таъсир бо ферментатсия алоқаманд буд, на бо нафаскашӣ

Таҳқиқоти Баррон дар соли 1930 аз суспензияҳои ҳуҷайравӣ ба буридаҳои бофтаи узвҳои муқаррарии калламуш ва омосҳои пайвандшуда гузашт.

Дар бофтаҳои бе гликолизи аэробӣ кабуди метиленӣ ҳеҷ таъсире надошт ё истеъмоли оксигенро каме бозмедошт: дар гурда тақрибан 14 дарсад, дар ғадуди зери меъда тақрибан 14 дарсад ва дар ҷигар тақрибан 5 дарсад. Дар бофтаҳое, ки дар ҳузури оксиген ферментатсия мекунанд, он истеъмолро зиёд кард: дар испурч тақрибан 8 дарсад ва дар мағзи сар тақрибан 13 дарсад. Афзоиш дар омосҳо аз тақрибан 27 дарсад дар карсиномаи синаи инсон то беш аз 80 дарсад дар саркомаи Рауси мурғ буд ва тақрибан ба гликолизи аэробии ҳар бофта мутаносиб меомад.

Расм: ҳар нуқта як навъи бофта аст. Меҳвари уфуқӣ гликолизи аэробиро нишон медиҳад; меҳвари амудӣ тағйири истеъмоли оксигенро пас аз илова кардани кабуди метиленӣ нишон медиҳад. Маълумот аз Баррон, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Ҷадвали 6, PMID 19869777.

Баъдан таҷрибаи сианид натиҷаи баръакс дод. Вақте ки нафаскашӣ дар он бофтаҳои қаблан беҷавоб бо сианид баста шуд ва ферментатсия зоҳир гардид, ранг боз истеъмоли оксигенро зиёд кард: дар гурда тақрибан 59 дарсад, дар ҷигар тақрибан 19 дарсад, дар испурч тақрибан 286 дарсад ва дар хоя тақрибан 200 дарсад.

Баррон пешниҳод кард, ки ранг метавонад барои санҷидани қобилияти ферментатсионии ҳуҷайра ё бофта истифода шавад ва дар охир як тахмин овард: парвариши наслҳои пайдарпайи омос дар муҳити дорои ранг шояд рӯзе мубодилаи моддаҳои омосро ба таври доимӣ ба мубодилаи моддаҳои бофтаи муқаррарӣ монанд кунад. Ин саволи таҳқиқотие буд, ки соли 1930 навишта шудааст. Он иддаои табобатӣ нест.

Таҷрибаҳо чиро чен карда наметавонистанд

Дар солҳои 1928 ва 1930 «нафаскашӣ» истеъмоли оксигенро ифода мекард. Аденозинтрифосфат бори аввал соли 1929 гузориш шуд ва соли 1949 нишон дода шуд, ки митохондрияҳои ҷудокардашуда ҳангоми интиқоли электронҳо фосфатро эстерификатсия мекунанд. Ҳеҷ яке аз мақолаҳои аввал дар бораи кабуди метиленӣ наметавонист истеҳсоли энергияро чен кунад ва ҳеҷ кадоми онҳо чунин иддао ҳам надошт.

Масъалаи дуюм худи ҳуҷайраҳост. Эритроситҳои болиғи ширхӯрон митохондрия надоранд. Дар марҳалаи ретикулосит онҳо митохондрияҳо ва рибосомаҳоро тавассути аутофагияи интихобӣ хориҷ мекунанд. Аз ҳамин сабаб ҳуҷайраи сурхи болиғ бо гликолиз фаъолият мекунад ва ба роҳи пентозофосфатии худ асосан барои NADPH такя мекунад, на барои ATP. Дар таҷрибаҳои соли 1928 ягон занҷири интиқоли электронҳо вуҷуд надошт, ки онро барқарор кардан мумкин бошад. Ҳар чизе, ки оксигенро истеъмол мекард, кори дигареро анҷом медод.

Имрӯз моҳияти он кори дигар ба қадри кофӣ хуб тавсиф шудааст. Кабуди метиленӣ электронҳоро аз эквивалентҳои барқароркунандаи ҳуҷайра қабул мекунад ва ба лейкометилени кабуд табдил меёбад. Он аз нав бо оксигени молекулавӣ оксид мешавад ва даврро мебандад. Дар ҳуҷайраҳои сурхи хуни инсон флавинредуктазаи вобаста ба NADPH ва дисулфидредуктазаҳои ҳамсон марҳалаи барқароршавиро иҷро мекунанд. Таҳқиқоти соли 1976 бо истифода аз глюкозаи нишонадор нишон дод, ки ранг шунти гексозамонофосфатиро фаъол мекунад, таъсири он дар консентратсияи паст ба оксигемоглобин вобаста аст ва консентратсияи баландтар — 0.1 mM — пероксиди гидроген ҳосил мекунад. Ранги барқароршуда ҳангоми вохӯрдан бо оксиген пероксид ҳосил мекунад, на пайвандҳои фосфатӣ.

Дар митохондрияҳо вазъият аз он чи хулосаҳои оммафаҳм эътироф мекунанд, баҳсноктар аст. Як самти таҳқиқот бар он аст, ки ранг электронҳоро аз минтақаи комплекси I мегирад ва ба ситохроми c медиҳад. Таҳқиқоти дигар муайян кард, ки дар митохондрияҳои мағзи сари муш он пас аз басташавӣ бо антимисин нафаскаширо барқарор карда наметавонад ва ба ҷойи ин макони қабулкунандаи электронро дар ҷойгоҳи пайвастшавии убихиноли комплекси III ҷой дод. Таҳқиқоти сеюм нишон дод, ки консентратсияҳои паст истеъмоли оксигенро дар ҳолати оромӣ зиёд мекарданд, вале нафаскашии бо ADP таҳрикёфта бетағйир мемонд. Баёни мустақимтарини ин нукта чунин аст: истеъмоли оксигени аз кабуди метиленӣ ба вуҷудомада умуман ба фосфоронии оксидшавӣ вобаста нест. Он ҳангоми боздоштани занҷири нафаскашӣ ва дар омодасозиҳои бе чунин занҷир низ идома мекард.

Андозагириҳои мустақими фарқи байни ин ду нишондиҳанда низ вуҷуд доранд. Дар митохондрияҳои ҷудокардашудаи ҷигари калламуш афзоиши консентратсияи ранг коэффисиентҳои назорати нафаскаширо паст карда, боиси варамшавӣ мешуд. Муаллифон инро ҷудошавии фосфоронии оксидшавӣ аз нафаскашӣ тавсиф карданд. Дар ҷигари калламуш, ки бо перфузия нигоҳ дошта мешуд, кабуди метиленӣ истеъмоли оксигенро зиёд мекард, дар ҳоле ки таносуби ATP ба ADP коҳиш меёфт.

Маълумоти клиникӣ ҳам ҳамин паёмро медиҳад. Метгемоглобинемия тавассути роҳи барқароршавии вобаста ба NADPH бо тақрибан як то ду миллиграмм кабуди метиленӣ ба ҳар килограмм, бо воридкунии дохиливаридӣ, табобат мешавад ва вояҳои калонтар худи ҳолати табобатшавандаро ба вуҷуд меоранд. Ҳамон баррасӣ қайд мекунад, ки таъсири зиддизаҳрӣ дар эритроситҳои солим бештар аст ва ҳангоми мавҷуд будани гемолиз кам мешавад. Ин ҳамон натиҷаи соли 1930 дар бораи гемолиз аст, ки пас аз ҳафтоду се сол дар шароити беморхона аз нав зоҳир мешавад. Вақте таъсирҳои муфид ва зараровари модда дар ду тарафи остонаи воя ҷой доранд, вояи онро набояд аз андозагирии истеъмоли оксиген хулоса кард.

Чаро силсилаи истеҳсолӣ бояд дар ин баҳс ҷой дошта бошад

Ҳарроп ва Баррон чизеро мушоҳида карданд, ки сазовори бозхондан аст. Худи кабуди метиленӣ дар спектроскоп байни ду банди хоси метгемоглобин бандеро ҳосил мекунад, «ки ҳангоми мушоҳидаи сатҳӣ метавонад ба осонӣ боиси иштибоҳ шавад». Ранг метавонад ба моддае монанд намояд, ки ҷустуҷӯ мешавад.

Ҳамин масъала шакли кимиёвӣ ҳам дорад. Фенотиазини ҳамсон, ки ҳамчун ҷузъи каммиқдор мавҷуд аст, рафтори оксидшавию барқароршавӣ, қобилияти гузариш ва заҳрнокии худро дорад. Як ҳолати ҳуҷҷатшуда аҳамияти масъаларо мушаххас мекунад: дар таҳқиқоти йодноккунии кабуди метиленӣ намунаҳое, ки тақрибан аз 7 то 8 дарсад Azure B доштанд, асосан Azure B-и йоднокшуда ҳосил карданд. Яъне дар реаксия на кабуди метиленӣ, балки омехтаи бегона бартарӣ дошт.

Ҳар касе, ки кабуди метилениро ҳамчун реактив дар озмоишгоҳ, дар мизи рангкунии намунаҳо ё дар аквариум истифода мекунад, то муайян шудани хусусиятҳои силсилаи истеҳсолӣ бо ҷузъи дақиқ муайяннашуда кор мекунад. Моддаҳои ҳамсон, ҳувияти модда, омехтаҳои элементии бегона, ҳалкунандаҳои боқимонда ва бақияи пас аз сӯзонидан қисми худи таҷрибаанд, на танҳо ҳуҷҷатҳои ҳамроҳи он. Blupreme кабуди метилении худро аз истеҳсолкунандаи дорусозӣ мегирад ва шаҳодатномаи пурраи таҳлилро нашр мекунад; дар он тамоми талаботи USP санҷида мешаванд, на танҳо металлҳои вазнин. Роҳнамои хондани шаҳодатномаи таҳлил ва нишонаи дараҷаи USP чиро тасдиқ мекунад ва чиро тасдиқ намекунад шарҳ медиҳанд, ки чӣ гуна ҳуҷҷатро бо иддао муқоиса кардан лозим аст.

Рақам дуруст буд

Таҷрибаҳои солҳои 1928 ва 1930 бодиққат гузаронда шуда буданд ва мушоҳидаи асосии онҳо то имрӯз эътибор дорад: ранги барқароршаванда метавонад ҳуҷайраеро, ки қариб нафас намекашад, водор кунад, ки оксигенро чандин баробар бештар аз суръати ҳолати оромии худ истеъмол намояд, бе гузаштан аз марҳалае, ки сианид онро мебандад.

Хато баъдтар пайдо мешавад, вақте ки «нафаскашӣ» бо маънои муосираш хонда мешавад. Андозагирии мубодилаи газ нишон медиҳад, ки электронҳо ба оксиген расиданд. Он намегӯяд, ки ягонтои онҳо барои ҳосил кардани ATP истифода шуд ва дар ҳуҷайраи бе митохондрия фосилаи байни ин ду гуфта то ҳадди имкон бузург аст. Харитаи васеътари таъсири кабуди метиленӣ дар ҳуҷайраҳо ҳамин фарқро дар заминаи васеътар ҷой медиҳад ва таърихи ин пайвастагӣ аз ранг то дору шарҳ медиҳад, ки чӣ гуна як рангдиҳандаи нассоҷӣ аслан ба ин таҷрибаҳо роҳ ёфт.