Spektra za FTIR na IR za Bluu ya Methilini: Mwongozo wa Utambuzi Maabarani

Fikiria maabara tatu zinapokea unga uleule wa buluu. Ya kwanza inarekodi spektramu ya infraridi na kutangaza kuwa ni bluu ya methilini. Ya pili inafanya kromatografia na kuripoti 0.4% Azure B. Ya tatu inatawanya eksirei kupitia fuwele na kutaja aina ya hidrati. Zote tatu ziko sahihi, na hakuna iliyojibu maswali yale mengine mawili. Mkanganyiko huanza pale matokeo ya kipimo kimoja yanapochukuliwa kana kwamba yanajibu maswali yote matatu.

Makala hii inatenganisha maswali hayo. Utambuzi kwa infraridi huthibitisha utambulisho wa molekuli kwa kuilinganisha na kiwango rejea. Kromatografia huthibitisha muundo wa viambato. Mtawanyiko huthibitisha umbo katika hali yabisi. Ulinganifu unaokidhi kipimo cha utambulisho si cheti cha usafi.

Utambuzi kwa infraridi hujibu swali moja vizuri

Kipimo cha utambulisho wa bluu ya methilini katika farmakopea ni ulinganisho wa spektramu dhidi ya kiwango rejea, si orodha ya kuhakiki vilele. Katika hakikisho la monografia ya USP ya bluu ya methilini, Utambuzi A unataja spektroskopia ya infraridi kwa kutumia ama vifaa vya optiki vya ATR au kidonge cha bromidi ya potasiamu. Spektramu ya sampuli lazima ilingane na spektramu ya kiwango rejea cha USP, huku sampuli na kiwango rejea vikiandaliwa na kurekodiwa katika hali zinazolingana. Hakuna orodha maalumu ya namba za mawimbi za utambuzi inayotoa uamuzi. Uamuzi hutolewa kwa kuzilaza spektra juu ya nyingine.

Uamuzi huo wa kubuni kipimo unaakisi tabia ya spektra za FTIR za bluu ya methilini. Sifa zenye nguvu zaidi zipo katika eneo la alama ya vidole. Maelezo katika fasihi ya kisayansi yanaweka kwa uthabiti bendi kuu ya pete zenye mfumo wa konjugesheni karibu na 1590 hadi 1600 cm-1, ambapo mitetemo ya kunyoosha vifungo vya kaboni-kaboni na kaboni-nitrojeni vya aromatiki huungana. Bendi nyingine karibu na 1490 na 1390 cm-1 zina sifa za mitetemo ya kubadilika kwa umbo la pete na vifungo vya kaboni-nitrojeni na kaboni-hidrojeni. Bendi karibu na 1355 na 1330 cm-1 zinahusisha vifungo vya kaboni-nitrojeni vya dimethylamino na mabadiliko ya umbo la vikundi vya methili. Sifa karibu na 1225 hadi 1250 cm-1 zinahusiana na kiunzi cha heterosikliki, huku bendi karibu na 1170 hadi 1130 na 1066 cm-1 zikiwa na sifa za kaboni-sulfuri, pamoja na mitetemo ya kupinda ya C-H ya aromatiki karibu na 880 cm-1. Mitetemo ya kunyoosha huonekana katika namba za mawimbi za juu zaidi: C-H ya aromatiki karibu na 3040 cm-1 na C-H ya N-methili kati ya takribani 2900 na 3000 cm-1. Maelezo yaliyochapishwa hutofautiana katika undani kwa sababu kiunzi cha phenothiazinium hutetemeka kama mfumo uliounganishwa, kwa hiyo ichukulie jedwali lolote moja la uhusishaji wa bendi kuwa maelezo yaliyoripotiwa, si tafsiri pekee inayowezekana.

Athari mbili za utayarishaji zinahitaji kuangaliwa kwa sababu hubadilisha spektra za IR za bluu ya methilini bila kubadilisha rangi yenyewe. Kwanza, nyenzo yenye maji ya hidrati huonyesha bendi pana ya O-H karibu na 3300 hadi 3500 cm-1 pamoja na mtetemo wa kupinda wa maji karibu na 1630 hadi 1640 cm-1, na aina tofauti za hidrati husogeza bendi za eneo la alama ya vidole kwa kiasi kinachoweza kupimwa. Pili, matriksi ya kidonge cha KBr hufyonza unyevu: unyevu uliofyonzwa hutokeza bendi katika maeneo hayo hayo ya maji na unaweza kuonekana kimakosa kuwa maji ya hidrati kutoka kwenye sampuli. Upimaji kwa ATR huepuka matriksi ya KBr, lakini nguvu za bendi za ATR hubadilika kulingana na kina cha upenyaji kinachotegemea namba ya wimbi, kwa hiyo spektramu ya ATR na spektramu ya upitishaji ya unga uleule haziwezi kulazwa moja juu ya nyingine moja kwa moja kwa ulinganisho. Kanuni ya vitendo inatokana na sharti la farmakopea: linganisha sampuli na kiwango rejea zilizorekodiwa kwa mbinu ileile, na andika mbinu iliyotumiwa. Kwa kemia ya msingi ya kationi, chumvi, na hidrati zinazoeleza spektra hizi, angalia rejea ya muundo na sifa za bluu ya methilini.

Jedwali la kuchagua mbinu ya uchanganuzi

Jedwali hili ni nyenzo ya kuchagua mbinu. Soma kila safu mlalo ili kujua ni swali gani mbinu inajibu, matokeo yanayokidhi masharti yanathibitisha nini, na nini kinabaki bila kuthibitishwa.

Mbinu	Swali inalojibu	Matokeo yanayokidhi masharti yanathibitisha nini	Kile ambacho haiwezi kuthibitisha
FTIR dhidi ya kiwango rejea	Je, nyenzo hii ni bluu ya methilini?	Utambulisho wa molekuli unaolingana na spektramu rejea	Usafi, aina na kiasi cha uchafu, aina ya hidrati peke yake, au mkusanyiko
Upimaji wa kiasi na uchafu wa kikaboni kwa HPLC-UV (safu ya fenili, 246 nm)	Kuna bluu ya methilini kiasi gani na Azure B kiasi gani?	Utambulisho wa kromatografia kwa ulinganifu wa muda wa kubaki; kiasi cha dutu na kiasi cha uchafu uliobainishwa	Umbo katika hali yabisi; utambulisho wa vilele visivyotarajiwa bila viwango rejea
LC-MS/MS yenye viwango rejea vilivyothibitishwa kufaa	Ni rangi zipi zilizoondolewa vikundi vya methili zipo?	Utenganishaji na utambuzi katika mfululizo wa MB, Azure A, Azure B, Azure C, thionine	Hadhi ya kukidhi farmakopea; huu ni upanuzi wa mbinu kwa kiwango cha utafiti, si kipimo cha kawaida cha monografia
XRD ya unga	Ni hidrati gani ya fuwele iliyopo?	Awamu katika hali yabisi, michanganyiko ya awamu iliyo juu ya kikomo cha utambuzi, na kiwango cha ufuwele	Utambulisho wa molekuli za uchafu usio na muundo wa fuwele; mkusanyiko wa myeyusho
Ufyonzaji wa UV-Vis	Je, myeyusho unafyonza kama inavyotarajiwa?	Vilele vya ufyonzaji vya tabia maalumu na mwenendo unaotegemea mkusanyiko	Utambulisho au usafi peke yake
Utambuzi wa kloridi na upungufu wa uzito baada ya kukausha (vipimo vya kusaidia)	Je, ioni yenye chaji kinzani ipo; ni kiasi gani cha uzito kinaweza kutoweka kwa uvukizaji?	Aina ya chumvi na uzito unaopungua baada ya kukausha katika hali zilizobainishwa	Ni molekuli gani inayotoa rangi

Kwa nini ulinganifu wa infraridi si cheti cha usafi

Ulinganifu wa utambulisho huondoa uwezekano wa kuwa rangi isiyo sahihi. Hauorodheshi kila kilichomo kwenye sampuli. Mapungufu matatu ni muhimu zaidi.

Kwanza, dutu zenye uhusiano wa karibu hufanana katika infraridi. Azure B hutofautiana na bluu ya methilini kwa kikundi kimoja tu cha methili, kwa hiyo spektramu yake hufanana sana na ya bluu ya methilini. Mchanganyiko wenye asilimia chache za Azure B bado unaweza kulingana vizuri unapolazwa juu ya spektramu rejea ya bluu ya methilini. Kutambua uchafu huo ni kazi ya kromatografia, inayofafanuliwa katika mwongozo wa uchafu wa bluu ya methilini na mbinu za upimaji.

Pili, spektroskopia ya infraridi ni mbinu inayopima sampuli kwa ujumla na ina uwezo mdogo wa kugundua viambato vilivyo kwa kiasi kidogo. Kiasi kidogo cha rangi zinazohusiana, vimumunyisho vilivyobaki, au mabaki yasiyo ya kikaboni hufichika chini ya bendi kuu. Kutokuwepo kwa vilele vya ziada ni ushahidi dhaifu wa kutokuwepo kwa uchafu.

Tatu, kiwango rejea ndicho kinachoamua ulinganisho mzima. Kiwango rejea kilichoharibika, ambacho spektramu yake imesogea kutokana na mabadiliko ya hidrati, au kilichoshughulikiwa vibaya hubadilisha msingi wa uamuzi. Vivyo hivyo, mbinu zisizolingana, kama spektramu ya sampuli ya ATR kutathminiwa dhidi ya rejea ya KBr, hubadilisha msingi huo. Rekodi kundi la kiwango rejea, mbinu, na utayarishaji pamoja na kila uamuzi.

Michanganyiko inaleta tahadhari ya mwisho. Spektramu inayolingana kwa sehemu kubwa lakini ina mabega ya vilele au nguvu za bendi zisizo za kawaida si matokeo yaliyofaulu yenye maelezo ya pembeni. Ni ishara ya kutenganisha sampuli kabla ya kuitambua.

Mbinu zinazokamilishana katika matumizi

HPLC ya bluu ya methilini hutoa jibu kuhusu viambato ambalo infraridi haiwezi kutoa. Mbinu ya sasa ya farmakopea hutumia safu ya aina ya fenili yenye mabadiliko ya uwiano wa maji na asetonitrili yaliyo na asidi ya trifluoroasetiki, na hufanya ugunduzi katika 246 nm, si katika eneo la mwanga unaoonekana. Utambulisho hutokana na ulinganifu wa muda wa kubaki na kiwango rejea; ulinganisho huo huo hutumika kupima kiasi cha dutu. Kipimo cha uchafu wa kikaboni hutambua Azure B kwa kutumia nyenzo yake yenyewe ya rejea katika muda wa kubaki wa uwiano wa karibu 0.8 dhidi ya bluu ya methilini katika 1.0, na kinahitaji utenganishaji wa hali ya juu kati ya vilele hivyo viwili. Zingatia uchaguzi wa urefu wa wimbi: mfululizo wa rangi zinazoondolewa vikundi vya methili hufyonza hatua kwa hatua zaidi kuelekea upande mwekundu, kuanzia thionine karibu na 600 nm kupitia Azure C, Azure A, na Azure B hadi bluu ya methilini karibu na 670 nm. Kwa hiyo, kigunduzi kilichowekwa karibu na 660 nm huitikia kwa viwango visivyo sawa katika mfululizo huo na huonyesha kiasi kidogo kuliko kilichopo cha baadhi ya homologi. Uchambuzi kamili wa mfululizo mzima, unapohitajika, unapaswa kufanywa kwa mbinu ya C18 LC-MS/MS yenye viwango rejea vilivyothibitishwa kufaa kwa kila dutu inayochanganuliwa.

Mtawanyiko wa unga hujibu swali la hali yabisi ambalo mbinu zote mbili hapo juu huharibu taarifa zake au hulipuuza: kuyeyusha unga kwa kromatografia hufuta taarifa za fuwele, na mitetemo ya molekuli hutoa taarifa kuhusu vifungo badala ya mpangilio wa masafa marefu. Mifumo ya mtawanyiko hutofautisha awamu za hidrati na kiwango cha ufuwele, na bluu ya methilini inahitaji uchunguzi huo zaidi ya nyenzo nyingi. Utafiti wa hali yabisi wa Rager na wenzake ulitambua miundo mitano tofauti ya hidrati, ikiwemo pentahidrati, dihidrati mbili, monohidrati, na hidrati ya kati, na haukupata trihidrati halisi miongoni mwa aina zilizochanganuliwa. Ushughulikiaji maabarani ni muhimu hapa: unyevunyevu na halijoto hubadilisha uthabiti wa hidrati, na kusaga kwa nguvu kunaweza kubadilisha awamu au kupunguza kiwango cha ufuwele, kwa hiyo dhibiti na urekodi unyevunyevu wa uwiano na halijoto, na punguza usagaji kadiri iwezekanavyo. Uwekaji wa lebo za hidrati na athari zake kwa uzito unaopimwa umejadiliwa zaidi katika aina za hidrati za bluu ya methilini na uwekaji wa lebo.

Ufyonzaji wa UV-Vis una jukumu la kusaidia. Vilele vinavyojulikana huthibitisha mwenendo unaotarajiwa wa myeyusho na kuwezesha upimaji wa mkusanyiko, lakini myeyusho wa buluu unaofyonza katika urefu wa wimbi unaotarajiwa unaendana na bluu ya methilini bila kuthibitisha kuwa ni hiyo, kwa kuwa rangi zinazohusiana hufyonza katika urefu wa mawimbi ulio karibu.

Nini cha kuuliza kabla ya kununua

Geuza tofauti hizi kuwa maswali ya ununuzi. Uliza ni kundi gani lililopimwa, ni mbinu gani iliyothibitisha utambulisho, kama kipimo cha uchafu cha HPLC kilitumia nyenzo rejea ya Azure B, na kama aina ya hidrati ilichanganuliwa au ilikadiriwa tu. Zaidi ya yote, uliza kama cheti kinashughulikia masharti yote ya ubora au vipimo vilivyochaguliwa tu. Wauzaji wengi wanaodai kukidhi farmakopea hupima metali nzito pekee, jambo linaloacha maswali ya utambulisho, kiasi cha dutu, uchafu wa kikaboni, vimumunyisho, na vijidudu bila majibu.

Blupreme hupima masharti yote ya USP, yanayojumuisha utambulisho, usafi, uchafu wa kikaboni, vimumunyisho vilivyobaki, uchafu wa elementi, mabaki baada ya kuchoma, vikomo vya vijidudu, na endotoksini za bakteria, kwa ushirikiano na mtengenezaji wa bluu ya methilini kwa matumizi ya kifamasia. Cheti cha uchanganuzi cha kila kundi kinachopatikana kwa umma huchapishwa kwenye upimaji wa ubora wa Blupreme, hivyo msingi wa upimaji wa kiasi na matokeo ya uchafu yanaweza kusomwa moja kwa moja badala ya kukisiwa. Matokeo yaliyo karibu na 100% bado yanahitaji msingi wa hesabu zake kubainishwa, kama mwongozo wa matokeo ya upimaji wa kiasi yaliyo juu ya asilimia 100 unavyoeleza. Ulinganifu wa utambulisho huanzisha uchunguzi. Rekodi kamili huukamilisha.