Metylenblått och leukometylenblått: ett redoxpar, två färger

En student tillsätter några droppar blått färgämne i en kolv, snurrar den och ser färgen försvinna. Hon skakar kolven och den blå färgen återkommer. Inget har tillsatts eller avlägsnats mellan de två tillstånden förutom elektroner och kontakt med luft. Kolven rymmer hela ämnet för den här artikeln: metylenblått och dess reducerade partner, leukometylenblått, som omvandlas till varandra i ett reversibelt redoxpar där färgen visar tillståndet.

Den praktiska poängen kommer först. Färgförändringen är ingen bieffekt här. Den är den analytiska signalen. Alla som formulerar med metylenblått, titrerar med det eller använder det i undervisning bör kunna skriva halvreaktionen ur minnet, ange förhållandena som driver den åt vänster eller höger och namnge föroreningarna som gör resultatet otydligt.

Paret i en enda ekvation

Oxiderat metylenblått är metyltioniniumkatjonen: ett plant fenotiaziniumsystem med svavel och kväve i den centrala ringen och en dimetylaminogrupp i vardera änden, som tillhandahålls som kloridsalt. PubChem registrerar det som metyltioniniumklorid, C.I. Basic Blue 9. I vatten absorberar monomeren nära 664 nm, vilket ger den blå färg som ögat ser.

Reducerat leukometylenblått (LMB) har samma grundstruktur, men med den centrala ringens kväve protonerat och kromoforen bruten. Det är oladdat nära neutralt pH och nästan färglöst, med försumbar absorbans i det synliga området och ett starkt ultraviolett band nära 258 nm (PubChems post för leukometylenblått, CAS 613-11-6). Antalet protoner i halvreaktionen beror på pH, eftersom den reducerade formen protoneras i sur miljö (ungefärliga pKa-värden nära 4.5 och 5.8). Tre regimer täcker det praktiska intervallet:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, blått <=> färglöst (nära neutralt pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), blått <=> färglöst (måttligt surt, 2 protoner)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> dubbelt protonerad leukoform (starkt surt, 3 protoner)

Alla tre skrivsätten beskriver samma par i olika protoneringstillstånd, något som litteraturen om tiazinfärgämnens redoxbeteende behandlar systematiskt. pH-beroendet följer Nernsts ekvation för Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, vilket ger en lutning på cirka 29.6, 59.2 eller 88.7 mV per pH-enhet för m = 1, 2 eller 3. Uppmätta lutningar nära 28, 58 och 87 mV per pH-enhet bekräftar tolkningen, så en angiven potential utan tillhörande pH är meningslös.

Vad ekvationen säger den som formulerar

Tre fakta följer av stökiometrin. För det första innebär två elektroner per molekyl att metylenblått i sin nettoreaktion är en tvåelektronindikator och -mediator, inte en bärare av en enda elektron. För det andra deltar protoner, så den formella potentialen ändras med pH enligt beskrivningen ovan. För det tredje ligger den formella potentialen vid pH 7 nära +0.011 V mot standardväteelektroden (cirka +0.53 V vid pH 0), vilket placerar paret bland milda oxidationsmedel: tillräckligt starkt för att ta emot elektroner från goda donatorer som NAD(P)H eller askorbat, men tillräckligt svagt för att lämna dem vidare till löst syre eller järn(III)-centra. Denna mellanposition är precis varför färgämnet kan växla mellan formerna i stället för att fastna i den ena.

Koncentrationen tillför ytterligare en komplikation. Över ungefär hundra mikromolar i vatten, i överensstämmelse med en rapporterad dissociationskonstant för monomer–dimer-jämvikten nära 170 till 250 uM vid pH 7, staplas de oxiderade katjonerna till dimerer och större aggregat med ett förskjutet absorptionsband nära 610 till 615 nm. Ett spektrum vars topp verkar ligga fel kan därför tyda på aggregation, inte föroreningar. Späd först och bedöm sedan.

Förhållanden som driver varje riktning

Tabellen nedan är en referens för laboratoriebänken. Reduktion kräver en elektrondonator; återoxidation kräver en elektronacceptor, och luft räcker vanligtvis.

Varje rad följer samma ekvation. Bara drivkraften ändras. Det är i den meningen paret är reversibelt: vägen är densamma, men reaktionen går i motsatta riktningar under motsatta förhållanden.

Blå flaskan, förklarad

Demonstrationens mekanism förtjänar en tydlig förklaring eftersom den visar paret i miniatyr. I alkalisk glukoslösning främjar basen glukosens enolisering, och det enediolat som bildas reducerar metylenblått till leukometylenblått, så kolvens innehåll blir färglöst. Skakning löser syre från gasutrymmet ovanför lösningen, syret återoxiderar leukoformen och den blå färgen återkommer. När kolven står stilla förbrukas det lösta syret nära reaktionszonen vid ytan, och glukosen får åter övertaget. Cykeln upprepas tills glukosen är förbrukad, och varje skakning synliggör Nernsts ekvation: öka oxidationsmedlets aktivitet så förskjuts jämvikten mot blått.

Radikalen i mitten

Nettoreaktionen överför två elektroner, men de elementära stegen överför en i taget. Mellan den blå katjonen och den färglösa leukoformen finns en semikinonradikal som mellanprodukt. Den disproportionerar huvudsakligen tillbaka till parets två former i stället för att ansamlas. Dess enelektronpotential nära minus 0.23 V vid pH 7 ligger långt under mittpotentialen för nettoreaktionen med två elektroner, vilket är anledningen till att radikalen endast förekommer i liten mängd vid stationärt tillstånd. Den är viktig av två skäl. Vid belysning når färgämnet exciterade tillstånd som öppnar radikalreaktionsvägar. Därför är metylenblåttlösningar ljuskänsliga, och därför bör fotokemi ingå i varje stabilitetsprotokoll. Vid hög koncentration dimeriserar dessutom den oxiderade formen, vilket förändrar spektrumet och den skenbara kinetiken utan att ändra det underliggande paret. Inget av detta upphäver reversibiliteten. Båda förklarar observationer som annars ser ut som irreversibilitet.

Demetylerade släktingar förskjuter skalan

Om metylgrupper avlägsnas från de två dimetylaminogrupperna består paret, men med förändrade egenskaper. Absorptionsmaximum förskjuts monotont mot kortare våglängder för varje demetylering: metylenblått nära 664 nm, Azure B nära 654, Azure A nära 630, Azure C nära 615 och tionin nära 600 nm. Azure B, som saknar en metylgrupp, är den närmaste släktingen: en viktig metabolit av metylenblått och en dokumenterad förorening i metylenblåttmaterial. Azure A och Azure C fortsätter serien med samma redoxaktiva grundstruktur. Tionin, där båda aminogrupperna är fullständigt demetylerade, ligger sist med en formell potential nära +0.06 V vid pH 7 jämfört med metylenblått vid +0.011 V och är därmed märkbart lättare att reducera. Redoxpotentialerna i serien beror på medium och elektrod, så jämför bara värden under samma förhållanden. Därför är kartläggning av föroreningar en redoxfråga, inte bara en kryssruta för renhet. Några procent Azure B innebär några procent av ett annat redoxpar i flaskan, och Azure B som förorening och metabolit beskriver hur den andelen kontrolleras.

Kopplingen till biologin

Inuti en röd blodkropp reducerar NADPH metylenblått till leukometylenblått, och leukoformen överför elektroner till hemjärn i järn(III)-tillstånd och återställer hemoglobinets järn(II)-tillstånd. Denna elektronförmedling är den kemiska grunden för användningen av metylenblått vid förvärvad methemoglobinemi. Allt som följer efter denna förmedling, energimetabolism, mitokondriellt elektronflöde och eventuella biologiska utfall, hör till mitokondriell elektrontransport och lämnas avsiktligt där.

Köp paret, inte bara färgen

Ett redoxfärgämne är aldrig bättre än sin specifikation. Hög renhet är viktig eftersom metylenblått som inte uppfyller USP vanligtvis är av textilkvalitet och innehåller Azure B, tungmetaller eller kvarvarande lösningsmedel som förskjuter redoxmätningar och gör slutpunkter otydliga, utan att något färgningsprotokoll kontrollerar detta. De flesta säljare som hävdar överensstämmelse med USP testar bara tungmetaller och anser sedan saken klar. Full överensstämmelse omfattar identitet, haltbestämning, organiska föroreningar, kvarvarande lösningsmedel, grundämnesföroreningar, glödgningsrest, mikrobiella gränsvärden och bakteriella endotoxiner, och så väljer du metylenblått av farmaceutisk kvalitet går igenom hur dokumentationen ska läsas. Blupreme samarbetar med en farmaceutisk tillverkare av metylenblått, testar enligt hela USP-specifikationen och publicerar det fullständiga analyscertifikatet (COA). När färgen är mätningen är den dokumentationen en del av instrumentet.